جستجو در کتاب ها   جستجو در مقالات   جستجو در کل سایت
تاریخ ثبت : شنبه 1 تير 1398 ساعت 56 : 2     میکروب شناسی جاوتز
بخش 1 مبانی میکروب شناسی - فصل 5 كشت ميكروارگانيسم ها

فصل 5  كشت ميكروارگانيسم ها

 

 

برای مطالعه سایر فصل های کتاب میکروب شناسی پزشکی جاوتز

(جهاندیده و جهاندیده)

بر روی فهرست کتاب

کلیک نمائید.

 

مقدمه

كشت فرآيند تكثير ارگانيسم ها با فراهم ساختن شرايط محيطى مناسب است. ميكروارگانيسم هاى در حال رشد، به توليد خود پرداخته و به عناصر حاضر در تركيب شيميايى خود نياز دارند. نوتريئنت ها بايد اين عناصر را به نحوی تأمين كنند كه از لحاظ متابوليكى قابل مصرف باشند. علاوه بر آن، ارگانيسم ها نيازمند انرژى جهت سنتز ماكروملكول ها و حفظ شيب شيميايى حياتى در عرض غشا هستند. فاكتور هايى كه بايد در طى رشد كنترل گردند عبارتند از : نوتريئنت ها، pH، دما، هوا دهى، غلظت نمك و قدرت يونى محيط كشت.

 

نيازمندى هاى رشد

بخش اعظم وزن خشك ميكروارگانيسم ها از مواد آلى تشكيل شده است. اين مواد آلى حاوى عناصر كربن، هيدروژن، نيتروژن، اكسيژن، فسفر و گوگرد مى باشند. بعلاوه، وجود يون های غيرآلى (معدنى) از قبيل پتاسيم، سديم، آهن، منيزيم، كلسيم و كلر براى تسهيل در عمل كاتاليزى آنزيم ها و نگاهداشت شيب غلظتى در عرض غشاى سلولى ضرورى است. معمولاً، ماده آلى به شكل ماكروملكول هايى است كه با ايجاد پيوند هاى آنيدريد (anhydride bonds) بين قطعات ساختمانى ساخته شده اند. سنتز پيوند هاى آنيدريد به انرژى شيميايى نياز دارد، كه اين انرژى توسط دو پيوند فسفو دى استر در ATP (آدنوزين ترى فسفات؛ فصل 6 را ببينيد) فراهم مىگردد. انرژى اضافىِ مورد نياز براى حفظ تركيب نسبتاً ثابت سيتوپلاسمى در طى رشد در انواعى از محيط هاى شيميايىِ خارج سلولى از نيروى محركه پروتون (proton motive force) ناشی می شود. نیروی محرکه پروتون یک انرژی بالقوه است که با عبور پروتون از عرض يك غشا پديد آيد. در يوكاريوت ها، اين غشا ممكن است بخشى از ميتوكندرى يا كلروپلاست باشد، اما در پروكاريوت ها، اين غشا، غشاى سيتوپلاسمى است.

    نيروى محركه پروتون يك شيب الكتروشيميايى است كه از دو جزء تشكيل مى گردد : اختلاف در pH (غلظت يون هيدروژن) و اختلاف در بار يونى. بار (شارژ) بر روى لبه بيرونى غشاى باكترى نسبت به شارژ موجود بر روى لبه درونى آن مثبت تر بوده و اين تفاوت در بار موجب رها شدن انرژى آزاد در هنگام ورود يك پروتون از لبه بيرونى غشا به درون سيتوپلاسم مى شود. فرآيند هاى متابوليكىِ توليد كننده نيروى محركه پروتون در فصل 6 به بحث گذارده شده اند. انرژى آزاد ممكن است براى حركت سلول، حفظ شيب های يونى يا ملكولى در سرتاسر غشا، سنتز پيوند هاى آنيدريد در ATP، يا براى مجموعه اى از اين اهداف مورد استفاده قرار گيرد. متناوباً، سلول ها نيز منبعى از ATP را ارائه مى دهند كه ممكن است انرژى پيوند آنيدريد آن براى ايجاد نيروى محركه پروتون به كار رود كه اين نيرو به نو به خود ممكن است براى به حركت در آوردن سلول و حفظ شيب هاى شيميايى استفاده شود.

    يك ارگانيسم در راستاى رشد، به تمامى عناصر موجود در ماده آلى خود و مجموعه كاملى از يون هاى ضرورى جهت انرژى و كاتاليز نياز دارد. بعلاوه، بايد منبعى از انرژى به منظور برقرارى نيروى محركه پروتون و اجازه سنتز ماكروملكولى وجود داشته باشد. ميكروارگانيسم ها در نيازمندى هاى تغذيهاى و منابع انرژى متابوليكى خود كاملاً متفاوت هستند.

 

منابع انرژى متابوليكى

سه مكانيسم اصلى براى توليد انرژى متابوليكى عبارتند از : تخمير، تنفس و فتوسنتز. براى رشد ارگانيسم، دست كم به كارگيرى يكى از اين مكانيسم ها ضرورى است.

 

تخمير

تشكيل ATP در تخمير با انتقال الكترون ها جفت نمى شود. تخمير با فسفريلاسيون سوسبسترا مشخص مى گردد، كه فرآيندى آنزيمى است كه در آن يك پيوند پيروفسفات به واسطه يك حد واسط متابوليكى فسفريله مستقیماً به ADP (آدنوزین دی فسفات) اعطا می شود. حدواسط های فسفریله در پى بازآرايى متابوليكىِ يك سوبستراىِ قابل تخمير نظير گلوكز، لاكتوز يا آرژينين شكل مى گيرند. از آنجايى كه تخميرات با تغيير در حالت اكسيداسيون ـ احياى كلى سوبستراى قابل تخمیر همراه نیستند، از این رو باید ترکیب عنصرىِ محصولات تخمیری با ترکیب عنصرىِ سوبسترا مشابه باشد. براى مثال، بازده تخمير يك ملكول گلوكز (C6H12O6) در مسير امبدن ـ ميرهوف (فصل 6 را ببينيد)، سود خالص دو پيوند پيرو فسفات در ATP بوده و دو ملكول اسيد لاكتيك (C3H6O3) توليد مى كند.

 

تنفس

تنفس همانند جفت شدن (اتصال) يك فرآيند وابسته به انرژى با دِشارژ نمودن (تخليه) يك باترى است. احياى شيميايى اكسيد كننده (پذيرنده الكترون) از طريق يك زنجيره ی اختصاصى از حاملين الكترون در غشأ، نيروى محركه پروتون را در عرض غشاى باكترى به وجود مى آورد. احياكننده (دهنده الكترون) ممكن است آلى يا غير آلى باشد : براى نمونه، اسيد لاكتيك به عنوان يك احيا كننده براى برخى ارگانيسم ها به خدمت گرفته مى شود، در حالى كه گاز هيدروژن يك احيا كننده در ديگر ارگانيسمها به شمار مى رود. اكسيژن گازى (O2) اغلب به عنوان یک اکسید کننده مورد استفاده است، اما اکسید کننده های دیگری که توسط برخی ارگانیسم ها به کار گرفته می شوند، شامل دی اکسید کربن (CO2)، سولفات (SO42-) و نيترات (NO3-)  مى باشند.

 

فتوسنتز

فتوسنتز مشابه تنفس است در اينكه احياى يك اكسيدكننده از راه زنجيره اى اختصاصى از حاملين الكترون، نيروى محركه پروتون را مستقر مى سازد. اختلاف اين دو فرآيند آن است كه در فتوسنتز، احياكننده و اكسيدكننده به طور فتوشيميايى با انرژى نورانىِ جذب شده به واسطه رنگدانه هاى موجود در غشا پديد مى آيند؛ بنابراين، فتوسنتز تنها مادامى كه منبع انرژى نورانى وجود داشته باشد مىتواند ادامه پيدا كند. گياهان و بعضى از باكترى ها قادرند مقدار كلانى از انرژى نورانى را در هزينه آب براى احياىCO2  سرمايه گذارى نمايند. در اين فرايند اكسيژن شكل مى گيرد، و ماده آلى توليد مى گردد. تنفس ـ از لحاظ انرژى، اكسيداسيون مطلوب ماده آلى توسط يك پذيرنده الكترون نظير اكسيژن ـ مى تواند انرژى ارگانيسم هاى فتوسنتزى را در غياب نور تأمين كند.

 

تغذيه

نوتريئنت ها (مواد غذايى) در محيط هاى رشد بايد شامل تمامى عناصر   مورد نياز براى سنتز بيولوژيك ارگانيسم هاى جديد باشند. در بحث زير، نوتريئنت ها طبقه بندى گرديده اند.

 

منبع كربن

همانگونه كه در بالا ذكر شد، گياهان و برخى باكترى ها قادرند انرژى فتوسنتزى را براى احياى دى اكسيد كربن در ازاى آب استفاده نمايند. اين ارگانيسم ها به گروه اتوتروف ها تعلق دارند كه براى رشد به نوتريئنت هاى آلى نيازمند نيستند. ساير اتوتروف ها شيميو ليتوتروف اند كه از یك سوبستراى غير آلى مانند هيدروژن يا تيو سولفات به عنوان احيا كننده و دىاكسيد كربن به عنوان منبع كربن استفاده مى كنند.

    هتروتروف ها براى رشد نيازمند كربن آلى هستند و اين ماده بايد در شكلى باشد كه بتواند جذب گردد. براى مثال، نفتالين مى تواند تمام كربن و انرژى مورد نياز براى رشد هتروتروفىِ تنفسى را فراهم سازد، اما تعداد بسيار كمى از ارگانيسم ها از مسير هاى متابوليكى لازم براى جذب آن برخوردار اند. از طرف ديگر، گلوكز مى تواند از رشد تخميرى يا تنفسى بسيارى از ارگانيسم هـا حمایت کند. این نکته حائـز اهمیت است کـه سوبسترا های رشد در سطوح مناسبی در اختیار سويه ميكروبىِ در حال رشد قرار گيرند : سطوحى كه از رشد يك ارگانيسم پشتيبانى مى نمايند، ممكن است رشد ارگانيسم ديگرى را باز دارند.

    دى اكسيد كربن براى تعدادى از واكنش هاى بيوسنتزى مورد نياز مىباشد. در بسيارى از ارگانيسم هاى تنفسى، دى اكسيد كربنِ توليدى بيش از مقدارى است كه نياز آنها را برآورده مى كند، اما سايرين نيازمند يك منبع دى اكسيد كربن در محيط رشد خود هستند.

 

منبع نيتروژن

نيتروژن يكی از اجزاى اصلى پروتئين ها، اسيد هاى نوكلئيك و تركيباتى ديگر است. اين عنصر تقريباً 5% از وزن خشك يك سلول باكتريايى معمولى را به خود اختصاص مى دهد. دى نيتروژن غيرآلى (N2) به وفور در طبيعت وجود داشته و 80% از اتمسفر زمين را شامل مى شود. نيتروژن در اين حالت بسيار پايدار است، زيرا اصولاً براى شكستن پيوند سه گانه نيتروژن ـ نيتروژن به انرژى فعال سازى زيادى نياز است. با اين وجود، نيتروژن ممكن است در اشكال متفاوت عرضه شود. ميكروارگانيسم ها در توانايى خود جهت جذب نيتروژن متفاوت هستند. (جدول 1-5). محصول پايانى همه مسير هاى جذب نيتروژن، احيا شده ترين فرم اين عنصر يعنى آمونياك (NH3) است. هنگامى كه NH3 در دسترس باشد، از طريق كانال هاى سرتاسرى غشا به شكل NH3 گازىِ محلول به جاى يون آمونيوم (NH4+) به درون اكثر باكترى ها انتشار پيدا مى كند.

    توانايى جذب N2 به طور حيا از راه NH3، كه تثبيت نيتروژن (nitrogen fixation) ناميده مـى شود، يـك ويژگى منحصر بـه پروكاريوت ها است، و تعداد نسبتاً كمى از باكترى ها قادر به شكستن پيوند سه گانه نيتروژن ـ نيتروژن هستند. اين فرآيند (فصل 6 را ببينيد) مستلزم صرف انرژى متابوليكى زيادى است و به سرعت نيز توسط اكسيژن غير فعال مى گردد. ظرفيت تثبيت نيتروژن در باكترى هاى بسيار واگرايى ديده مى شود كه تدابير بيوشيميايى كاملاً متفاوتى را براى محافظت از آنزيم هاى تثبيت كننده نيتروژن در برابر اكسيژن، تكامل داده اند.

    اكثر ميكروارگانيسم ها قادرند از NH3 به عنوان تنها منبع نيتروژن استفاده كنند، و بسيارى از ارگانيسم ها داراى توانايى توليد NH3 از آمين ها (R-NH2) يا از اسيد هاى آمينه (RCHNH2COOH)، عموماً به طور   داخـل سلولى هستند. توليد NH3 از دِآمينه شدن اسيد هـاى آمينه آمونيفيكاسيون نام دارد. آمونياك به واسطه مسير هاى بيوشيميايى اى كه در آنها گلوتامات و گلوتامين درگير اند، به درون ماده آلى راه مى يابد. اين مسير ها در فصل 6 به بحث گذارده شده اند.

    بسيارى از ميكروارگانيسم ها از توانايى جذب نيترات (NO3-) و نيتريت (NO2-) از راه احيا، با تبديل اين يون ها به NH3 برخودار اند. اين فرآيند ها به ترتيب احياى جذبى نيترات (assimilatory nitrate reduction) و احياى جذبى نيتريت (assimilatory nitrite reduction) ناميده مى شوند. اين مسير هاى جذب از مسير هاى مورد استفاده براى سوخت (dissimilation) نيترات و نيتريت متفاوت مى باشند. مسير هاى جذب توسط ميكروارگانيسم هايى كه اين يون ها را به عنوان پذيرندگان نهايى الكترون در تنفس به كار مـى بـرند، مورد استفاده قرار مىگيرند. بـرخى باكترى هاى اتوتروف (براى مثال، نيتروزوموناس و نيتروباكتر) قادرند تحت شرايط بى هوازى، NH3 را به گاز N2 تبديل كنند. اين فرآيند دنيتريفيكاسيون نام دارد. درك ما از چرخه نيتروژن رو به تكامل است. در اواسط دهه 1990، واكنش آناموكس (anammox) كشف شد. واكنش

كه در آن آمونياك به وسيله نيتريت اكسيد مى شود، فرآيندى ميكروبى است كه در آب هاى فاقد اكسيژن اقيانوس رخ داده و يك مسير اصلى بازگشت نيتروژن به اتمسفر محسوب مى گردد.

 جدول 1-5. منابع نيتروژن در تغذيه ميكروبى

تركيب

ظرفيت N

NO3-

5+

NO2-

3+

N2

0

NH4+

3-

R-NH2*

3-

 

*: R، بنيان آلى.

 

منبع گوگرد

به سان نيتروژن، گوگرد نيز يكى از اجزاى تركيبىِ تعداد زيادى از مواد آلى سلول است. اين عنصر بخشى از ساختار چند كوآنزيم را شكل داده و در زنجيره هاى جانبى سيستئينيل و متيونيل پروتئين ها يافت مى شود. گوگرد در فرم عنصرى آن نمى تواند توسط گياهان يا حيوانات مورد بهره بردارى قرار گيرد. هرچند، برخى از باكترى هاى اتوتروف قادرند آن را به سلوفات (SO42-) اكسيد نمايند. اكثر ميكروارگانيسم ها مى توانند از سولفات به عنوان منبع گوگرد استفاده و آن را تا سطح سولفيد هيدروژن (H2S) احيا كنند. بعضى از ميكروارگانيسم ها توانايى جذب مستقيم H2S را از محيط رشد دارند، اما اين تركيب مى تواند براى بسيارى از ارگانيسم ها سمى باشد.

 

منبع فسفر

فسفات (PO43-) به عنوان يك جزء تركيبى ATP، اسيد هاى نوكلئيك و همچنين كوآنزيم هايى مانند NAD و NADP، و فلاوين ها مورد نياز است. بعلاوه، تعداد زيادى از متابوليت ها، ليپيد ها (فسفو ليپيد، ليپيد A)، اجزاى ديواره سلولى (اسيد تيكوئيك)؛ برخى از پلى ساكاريد هاى كپسولى، و بعضى از پروتئين ها فسفريله اند. فسفات هميشه به صورت فسفات غير آلىِ آزاد يا Pi (inorganic phosphate free) جذب مى شود.

 

منابع معدنى

مواد معدنى متعددى براى عملكرد آنزيمى مورد نياز هستند. يون منيزيم (Mg2+) و يون آهن نیز در مشتقات پورفيرين يافت مى شوند: منيزيم در ملكول كلروفيل و آهن به عنوان بخشى از كوآنزيمهاى سيتوكروم ها و پراكسيداز ها حضور دارد. Mg2+ و K+ هر دو براى كارآيى و بى نقصى ريبوزوم ها حياتى اند. Ca2+ به عوان يك جزء تشكيلاتىِ ديواره سلولى گرم مثبت مورد نياز است، اما براى باكترى هاى گرم منفى غير ضرورى مى باشد. بسيارى از ارگانيسم هاى دريازى براى رشد به Na+ احتياج دارند. در طى فرمولاسيون يك محيط براى كشت دادن اكثر ميكروارگانيسم ها، لازم است تا منابع پتاسيم، منيزيم، كلسيم و آهن ـ معمولاً در قالب يون هاى آنها (K+، Mg2+، Ca2+، و Fe2+) - تأمين گردند. بسيارى از مواد معدنى ديگر (مانند Mn2+، Mo2+، Co2+،  Cu2+و Zn2+) مورد نياز اند. اين مواد غالباً مى توانند به صورت به دام افتاده در آب يا آلاينده ی ساير عناصر محيط كشت تأمين شوند.

    جذب آهن كه هيدروكسيد هاى نامحلول در pH خنثى را به وجود مىآورد، در بسيارى از باكترى ها و قارچ ها به واسطه توليد سيدروفور ها (تركيباتى كه آهن را جذب نموده و انتقال آن را به صورت يك كمپلكس محلول، به پيش مىبرند) تسهيل مىگردد. آنها شامل هيدروكسامات ها (-CONH2OH) موسوم به سيدرامين ها، و مشتقات كاتِكول (مانند 2و3- دى هيدروكسى بنزوئيل سرين) هستند. سيدروفور هاى به رمز در آمده توسط پلاسميد در تهاجم برخى باكترى هاى پاتوژن نقشى اساسى را بر دوش مىكشند (فصل 7 را ببينيد). مكانيسم هاى جذب آهن وابسته به سيدروفور و مستقل از سيدروفور در فصل 9 به بحث گذارده شده اند.

 

فاكتور هاى رشد

يك فاكتور رشد (growth factor) تركيبى آلى است كه سلول قادر به سنتز آن نبوده و براى رشد بايد آنرا كسب نمايد. بسيارى از ميكروارگانيسمها هنگامى كه مواد غذايى ذكر شده در بالا براى آنها فراهم باشد قادر به ساخت تمامى قطعات ساختمانى ماكروملكولهاى خود (شكل 1-5)، يعنى اسيد هاى آمينه؛ پورين ها، پيريميدين ها، و پنتوز ها (پيشساز هاى متابوليكى اسيدهاى نوكلئيك)؛ هيدرات هاى كربن اضافى (پيش ساز هاى پلى ساكاريد ها)؛ و اسيد هاى چرب و تركيبات ايزوپرنوئيد هستند. بعلاوه، ارگانيسم هاى آزاد زى بايد توانايى سنتز ويتامين هاى پيچيده اى را كه به عنوان پيشساز هاى كوآنزيم ها به كار مى گيرند، داشته باشند.

    هر يك از تركيبات حياتى توسط يك زنجيره مجزایی از واكنش هاى آنزيمى سنتز مى گردند؛ هر آنزيم تحت كنترل يك ژن خاص توليد مى شود. هنگامى كه ارگانيسمى يك جهش ژنى را متحمل شود كه نتيجه آن نقص در عملكرد يكى از اين آنزيم ها باشد، زنجيره مى شكند و محصول پايانى توليد نمى گردد. آنگاه، ارگانيسم بايد آن تركيب را از محيط به دست آورد : تركيب به يك فاكتور رشد براى ارگانيسم تبديل مى شود. اين نوع از جهش را مىتوان به سهولت در آزمايشگاه ايجاد نمود.

    گونه هاى ميكروبى مختلف در نيازمندى هاى فاكتور رشد خود بسيار متنوع اند. اين تركيبات در همه ارگانيسم ها يافت شده و براى همه آنها حياتى است؛ اختلافات در نيازمندى ها بازتاب تفاوت ها در توانايى هاى سنتز است. برخى گونه ها به فاكتور هاى رشد نياز ندارند، در حالى كه سايرين ـ مانند بعضى از لاكتوباسيلوس ها ـ در جريان تكامل، توانايى سنتز 40-30 تركيب ضرورى را از دست داده اند، و از اين رو وجود اين فاكتور ها در محيط كشت آنها الزامى است.

 

كشت ميكروارگانيسم ها - غلظت نمك - قدرت يونى محيط كشت - نيازمندى هاى رشد - پيوند هاى آنيدريد (anhydride bonds) - نيروى محركه پروتون - proton motive force - شيب الكتروشيميايى - pH (غلظت يون هيدروژن) - منابع انرژى متابوليكى - تخمير، تنفس و فتوسنتز - تخمير - تشكيل ATP - فسفريلاسيون سوسبسترا - ADP (آدنوزین دی فسفات) - ملكول گلوكز (C6H12O6) - مسير امبدن ـ ميرهوف - اسيد لاكتيك (C3H6O3) - فتوسنتز - نوتريئنت ها (مواد غذايى) - منبع كربن - رشد تخميرى يا تنفسى - منبع نيتروژن - يون آمونيوم (NH4+) - تثبيت نيتروژن - nitrogen fixation - آمين ها (R-NH2) - اسيد هاى آمينه (RCHNH2COOH) - نيترات (NO3-) - نيتريت (NO2-) - احياى جذبى نيترات - assimilatory nitrate reduction - احياى جذبى نيتريت - assimilatory nitrite reduction - سوخت (dissimilation) - باكترى هاى اتوتروف - نيتروزوموناس - نيتروباكتر - فرآيند دنيتريفيكاسيون - واكنش آناموكس (anammox) - منبع گوگرد - Pi - سولفيد هيدروژن (H2S) - فسفات غير آلىِ آزاد - inorganic phosphate free - منابع معدنى - هيدروكسامات ها (-CONH2OH) - سيدرامين ها - مشتقات كاتِكول - دى هيدروكسى بنزوئيل سرين - فاكتور هاى رشد - growth factor - عناصر کمیاب - trace elements - غلظت يون هيدروژن (pH) - نوتروفيل ها -

شكل 1-5. سنتز ماكروملكولى. پليمريزاسيون قطعات ساختمانى به ماكرو ملكول ها عمدتاً با ايجاد پيوند هاى آنيدريد حاصل مى گردد. تشكيل اسيد هاى چرب از استات مستلزم چند مرحله احياى بيوشيميايى با استفاده از دهنده هاى آلى هيدروژن يا D.H2  (hydrogen donor) است.

 

فاكتور هاى محيطى اثر گذار بر رشد

 

يك محيط رشد مناسب بايد در  بر گيرنده ی تمامى نوتريئنت هاى مورد نياز براى ارگانيسم كشت شونده باشد، و همچنين فاكتور هايى از قبيل pH، دما و هوا دهى بايد به دقت كنترل گردند. محيط مايع مورد استفاده است؛ يك محيط مايع را مىتوان با افزودن آگار يا ژل سيليكا براى اهداف خاصى به صورت ژله در آورد. آگار، پلى ساكاريدى است كه از جلبك دريايى استخراج مى شود و طور منحصر به فردى براى كشت ميكروبى مناسب است، زيرا به فعاليت ميكروبى مقاوم بوده و همچنين در دماى C°100 به حالت محلول   در مى آيد و ژلهاى نمى گردد مگر آنكه تا پايين تر از دماى C°45 خنك شود؛ سلول هـا را مى تـوان در محيط كشتى كه دماى C°45 دارد سوسپانسيون نمود و سپس اين محيط را جهت ژله اى شدن سريعاً سرد كرد، تا به سلول ها آسيبى نرسد.

 

نوتريئنت ها

در صفحات قبل، عمل هر يك از نوتريئنت ها شرح داده شد و ليستى از مواد مناسب ارائه گرديد. به طور كلى، مواد زير بايد فراهم شوند : (1) دهنده ها و پذيرنده هاى هيدروژن : در حدود g/L2؛ (2) منبع كربن : در حدود g/L1؛ (3) منبع نيتروژن : در حدود g/L1؛ (4) مواد معدنى : گوگرد و فسفر، هر يك در حدود mg/L50، و عناصر کمیاب (trace elements)، از هر يك mg/L1-1/0؛ (5) فاكتور هـاى رشد : اسيد هـاى آمينه، پورين هـا و پيريميدين هـا، از هر يك در حدود mg/L50، و ويتامين هـا از هر يك mg/L1-1/0.

    براى مطالعات متابوليسم ميكروبى، معمولاً آماده ساختن يك محيط مصنوعىِ كامل كه در آن ويژگى ها و غلظت هاى دقيق هر كدام از عناصر معلوم باشد لازم است. از جهات ديگر، استفاده از مواد طبيعى نظير عصاره مخمر، پروتئين هضم شده، يا مواد مشابه بسيار ارزان تر و ساده تر است. اكثر ميكروب هاى آزاد زى به خوبى روى عصاره مخمر رشد خواهند نمود؛ اشكال انگلى ممكن است به موادی اختصاصى نياز داشته باشند كه تنها در خون يا عصاره هاى بافتى حيوانات يافت مى شوند. با اين همه، ميكروب هاى انگلى اى وجود دارند كه نمى توانند در شرايط آزمايشگاهى رشد نمايند (مانند ترپونما پـاليدوم) و يـا آنكه درون سلول هـاى يـوكـاريوتى رشد مى كنند (مانند كلاميديا تراكوماتيس).

    براى بسيارى از ارگانيسم ها، يك تركيب منفرد (نظير يك اسيد آمينه) ممكن است به عنوان منبع انرژى، منبع كربن و منبع نيتروژن عمل كند؛ ديگر ارگانيسم ها براى هر كدام از منابع فوق به تركيب مجزايى نياز دارند. چنانچه مواد طبيعىِ به كار رفته در محيط هاى مصنوعى در هر يك از نوتريئنت ها ناكافى باشند، آن نوتريئنت را بايد به صورت مكمل افزود.

 

غلظت يون هيدروژن (pH)

اكثر ارگانيسم ها داراى محدوده نسبتاً باريكى از  pHبهينه هستند. pH بهينه بايد به طور تجربى براى هر گونه تعيين شود. اغلب ارگانيسم ها (نوتروفيلها) بهترين رشد شان در 8-6=pH است، اگرچه برخى از آنها (اسيدوفيلها) pH بهينه پايين يعنى 3=pH و سايرين (آلكاليفيل ها) pH بهينه بالا يعنى 5/10=pH دارند.

    ميكروارگانيسم ها pH درونى خود را روى محدوده وسيعى از ارزش هاى pH خارجى با پمپ كردن پروتون ها به داخل يا خارج سلول تنظيم مى نمايند. اسيدوفيل ها (اسيد دوست ها)، pH داخلى را در حدود 5/6 روى يك محدوده بيرونى 5-1 نگه مى دارند؛ نوتروفيل ها (خنثى دوست ها)، pH درونى را در حدود 5/7 روى يك محدوده خارجى 5/8-5/5  حفظ مى كنند؛ آلكاليفيل ها (قلیایی دوست ها) pH درونی را در حدود 5/9 روی محدوده خـارجیِ 11-9 نگه مـى دارنـد.pH  درونى به وسيله مجموعـه اى از سيستم هـاى انتقال پروتون در غشاى سيتوپلاسمى، شامل يك پمپ اوليه ی پروتون راه اندازى شونده توسط ATP و يك تبادل گر Na+/H+ به نظم در مى آيد. دست داشتن يك سيستم تبادل K+/H+ نيز براى تنظيم pH درونى در نوتروفيل ها پيشنهاد شده است.

 

دما

گونه هاى ميكروبى مختلف در محدوده هاى دماى بهينه خود براى رشد كاملاً متفاوت هستند (شکل 2-5) : اشكال سايكروفيل (سرما دوست) بهترين رشد را در دما هاى پايين (C°15- 5-) نشان مى دهند و معمولاً در محیط هایی مانند قطب شمال و قطب جنوب یافت می شوند. سایکروتروفها از دمای بهینه بین C°20 و C°30 برخوردار اند، اما در دما های پایین تر به خوبی رشد می کنند. آنها عامل مهمی در فساد مواد غذایی به شمار می روند. اشكال مزوفيل (ميان دما دوست) در دماى C°37-30 رشد بهترى دارند، و اكثر اشکال ترموفيل (گرما دوست) در دماى C°60-50 بهتر رشد مى كنند. برخى از ارگانيسم ها هايپرترموفيل (شديداً گرما دوست) بوده و مىتوانند بالاتر از دماى آب جوش ـ كه تحت فشار بالا در اعماق اقيانوس وجود دارد ـ رشد نمايند. اغلب ارگانيسم ها مزوفيل اند؛ C°30 دماى بهينه بـراى بسيارى از اشكال آزاد زى است، و دمـاى بدن ميزبـان بـراى همزيست هاى حيوانات خونگرم بهينه مى باشد.

    حد فوقانىِ محدوده دمايىِ قابل تحمل براى هر گونه ی معلوم با پايدارى دمايى پروتئين هاى آن گونه، كه در عصاره هاى سلولى سنجيده مى شود، كاملاً مرتبط است. ميكروارگانيسم ها با گياهان و حيوانات در پاسخ شوك حرارتى (heat-shock response) – سنتز گذراى «پروتئين هاى شوك حرارتى» – مشترك مى باشند. اين شوك زمانى پديد مى آيد كه افزايشی ناگهانى در دما رخ دهد و دما به حد بالا تر از دماى بهينه رشد برسد. اين پروتئين ها ظاهراً به طور غير عادى نسبت به حرارت مقاوم بوده و پروتئين هاى سلولىِ حساس به حرارت را پايدار مى كنند.

    ارتباط سرعت رشد با دما براى هر ميكروارگانيسم معلوم در طرح ويژه آرنيوس ديده مى شود (شكل 3-5). آرنيوس نشان داد كه لگاريتم سرعت هر واكنش شيميايى(log k)  تابع خطىِ معكوس دما (T/1) است؛ از آنجايى كه رشد سلول ماحصل مجموعه اى از واكنشهاى شيميايى مى باشد، ممكن است انتظار مشاهده اين رابطه برود. شكل 3-5 محدوده دمايى نرمال (طبيعى) را براى يك گونه معلوم نشان مى دهد؛ log k به طور خطى با T/1 كاهش مى يابد. اگرچه، در بالا و پايين محدوده نرمال، log k به سرعت افت مى نمايد، به نحوى كه ارزش هاى دمايى بيشينه و كمينه تعريف شده هستند.

    افزايش درجه حرارت، صرف نظر از تأثيراتى كه بر روى رشد مى گذارد، سبب مرگ ميكروارگانيسم ها مى شود. حرارت شديد براى استريل نمودن مورد استفاده قرار مى گيرد (فصل 4 را ببينيد)؛ دماى پايين نيز باعث كشتن سلول هاى ميكروبى خواهد شد، اگرچه اين دما نمى تواند جهت استريليزاسيونِ مطمئن به كار رود. باكترى ها همچنين پديده اى را به نام شوك سرمايى (cold shock) نشان مى دهند : مرگ سلول ها در پى سرد شدن سريع آنها بر خلاف سرد شدن آهسته. براى مثال، سرد نمودن سريع اشريشياكولى از C°37 به C°5 مىتواند %90 از سلول ها را بكشد. تعدادى از تركيبات (كه رايج ترين آنها گليسرول و دى متيل سولفوكسيد اند) سلول ها را در برابر يخ زدگى يا شوك سرمايى مصون مى دارند.

 

شکل 2-5. نیازمندی های دمایی برای رشد. پروکاریوت ها معمولاً بر پایه درجه حرارت های بهینه رشد خود، در قالب پنج گروه تقسیم می گردند. توجه نمایید که دمای بهینه، نقطه ای که در آن میزان رشد در بالا ترین حد  است، نزدیک به محدوده ی فوقانی طیف دمایی می باشد.

 

اسيدوفيل ها - آلكاليفيل ه - نوتروفيل ها (خنثى دوست ها) - آلكاليفيل ها (قلیایی دوست ها) - اشكال سايكروفيل (سرما دوست) - اشکال ترموفيل (گرما دوست) - هايپرترموفيل (شديداً گرما دوست) - پاسخ شوك حرارتى - heat-shock response - پروتئين هاى شوك حرارتى - قدرت يونى و فشار اسمزى - فشار اسمزى - غلظت نمك - اسموفيل (فشار اسمزى دوست) - اسمولاريته (حالت اسمزى) - محيط كشت - بررسى ميكروبيولوژيكى مواد طبيعى - جدا سازى يك نوع خاص از ارگانيسم - تثبيت كنندگان هوازى نيتروژن (ازتوباكتر) - كشت غنى - enrichment culture - محیط غنى طبيعى - natural enrichment -  محیط های انتخـابی - selective media -    محیط های افتراقی  - differential media -  ائوزين و متلين بلو  - EMB آگار -  جدا سازى ميكروارگانيسم ها در كشت خالص - كشت خالص - pure culture - كشت در محيط جامد -

شكل 3-5. فرم كلى از يك طرح آرنيوس در رشد باكتريايى.

 

هوا دهى

نقش اكسيژن به عنوان پذيرنده هيدروژن در فصل 6 بحث شده است. بسيارى از ارگانيسم ها هوازى اجبارى بوده، به طور ويژه نيازمند اكسيژن به عنوان پذيرنده هيدروژن مى باشند؛ برخى اختيارى هستند، و قادرند به طور هوازى يا بى هوازى زيست نمايند؛ و بعضی بى هوازى اجبارى اند و به  ماده اى غير از اكسيژن به عنوان پذيرنده هيدروژن نياز داشته و به اكسيژن حساسيت دارند؛ بعضی میکروآئروفیل می باشند که به مقادیر اندکی از اکسیژن (10-2 درصد) برای تنفس هوازی نیاز دارند (غلظت های بالاتر مهار کننده اند)؛ و سایرین بی هوازی های آئروتولرانت هستند، که نسبت به اکسیژن متفاوت اند. آنها در حضور اکسیژن رشد می کنند، اما از آن به عنوان یک گیرنده ی هیدروژن بهره نمی برند (شکل 4-5).

 

شکل 4-5. نیازمندی های اکسیژن (O2) پروکاریوت ها.

 

    محصولات فرعىِ طبيعى متابوليسم هوازى، تركيبات واكنش پذير پراكسيد هيدروژن (H2O2) و سوپر اكسيد(O2-)  هستند. اين دو نوع محصول مىتوانند در حضور آهن، راديكال هاى هيدروكسيل (OH•) را توليد كنند كه قادر است به هر ماكروملكول زيستى آسيب وارد سازد :

    تعداد زيادى از هوازى ها، و بى هوازى هاى تحمل كننده هوا (آئروتولرانت) به واسطه داشتن سوپر اكسيد ديسموتاز، آنزيمى كه واكنش زير را كاتاليز مى كند :

و كاتالاز، آنزيمى كه به كاتاليز واكنش زير مى پردازد :

خود را از اين محصولات در امان نگه مى دارند.

    برخى از ارگانيسم هاى تخميرى (مانند لاكتوباسيليوس پِلانتاروم) تحمل كننده هوا بوده، اما داراى كاتالاز يا سوپر اكسيد ديسموتاز نيستند. اكسيژن در آنها احيا نمى شود و از اين رو H2O2 و O2- توليد نمى گردند. تمام بىهوازى هاى اجبارى فاقد سوپر اكسيد ديسموتاز و كاتالاز هستند. تعدادى از بى هوازى ها (مانند پپتوكوكوس آنائروبيوس) به طور قابل ملاحظه اى اكسيژن را تحمل مى نمايند، زيرا توانايى توليد سطوح بالايى از يك آنزيم (NADH اكسيداز) را دارند كه اكسيژن را طبق واكنش زير به آب احيا مى كند :

    پراكسيد هيدروژن از خاصيت سمى بالايى برخوردار بوده و به آسيب DNA منجر می شود. جهش یافته هایی که در ترمیم DNA دچار نقص شده اند، به طور استثنايى به پراكسيد هيدروژن حساس اند؛ نشان داده شده است كه اهميت محصول ژن recA ـ كه هم در نوتركيبى ژنتيكى و هم در ترميم DNA عمل مى كند ـ در حفاظت اشريشياكولى در برابر سميت پراكسيد هيدروژن، از كاتالاز يا سوپر اكسيد ديسموتاز بيشتر است.

    تأمين هوا در كشت هوازى ها يك مشكل تكنيكى است. ظروف كشت را معمولاً به طور مكانيكى تكان مى دهند تا اكسيژن به درون محیط راه یابد، یا هوا را با فشار به داخل محیط می فرستند. انتشار اكسيژن اغلب يك فاكتور محدود كننده در رشد باكترى هاى هوازى به شمار مى رود؛ هنگامى كه غلظت سلول به mL/109×5-4 برسد، كاهش در سرعت انتشار اكسيژن سريعاً از سرعت رشد اضافى ممانعت به عمل مى آورد.

    از طرف ديگر، در بىهوازى هاى اجبارى، خارج نمودن اكسيژن يك مسأله است. براى اين منظور، روش هاى بسيار زيادى در دسترس مى باشند : عوامل احيا كننده نظير سديم تايو گليكولات را مى توان به كشت هاى مايع افزود؛ لوله هاى آگار را مى توان با لايه اى از وازلين و پارافين مهر و موم نمود؛ ظرف كشت را مى توان در محفظه اى قرار داد كه در آن اكسيژن به واسطه تخليه يا از راه هاى شيميايى برداشته شده است؛ يا مىتوان ارگانيسم را درون يك محفظه بى هوازى مديريت كرد.

 

قدرت يونى و فشار اسمزى

فاكتور هايى از قبيل فشار اسمزى و غلظت نمك ممكن است به ميزان كمترى كنترل گردند. براى اكثر ارگانيسم ها، ويژگى هاى محيطهاى معمولى رضايت بخش است؛ با اين حال، براى اشكال دريا زى و ارگانيسم هايى كه براى رشد در محلول هاى قندىِ بالا سازش يافته اند، اين فاكتور ها را بايد  در نظر گرفت. ارگانيسم هاى نيازمند به غلظت هاى بالاى نمك، هالوفيل (نمك دوست) ناميده مى شوند؛ آنهايى كه به فشار اسمزى بالا نياز دارند اُسموفيل (فشار اسمزى دوست) نام دارند.

    بيشتر باكترى ها قادرند محدوده وسيعى از فشار هاى اسمزى و قدرتهاى يونى خارجى را تحمل نمايند، زيرا توانايى تنظيم اسمولاريته و غلظت يونىِ درونى را دارا هستند. اسمولاريته (حالت اسمزى) با انتقال فعال يون هاى K+ به درون سلول تنظيم مى گردد؛ قدرت يونىِ داخلى نيز توسط دفع جبرانى پلى آمين آلىِ پوترِسينِ داراى بار مثبت، ثابت نگه داشته مى شود. از آنجايى كه پوترسين چندين بار مثبت را در هر ملكول حمل مى نمايد، يك افت شديد در قدرت يونى تنها اندكى در فشار اسمزى تأثير مى گذارد.

 

روش هاى كشت

دو مسأله بايد لحاظ گردد: انتخاب محيط مناسب و جدا سازى ارگانيسم باكتريايى در كشت خالص.

 

محيط كشت

تكنيك مورد استفاده و نوع محيطى كه انتخاب مىشود به ماهيت تحقيق بستگى دارد. به طور كلى، ممكن است با سه وضعيت روبه رو شد : (1) شخصى ممكن است به افزايش محصول سلول هاى يك گونه خاص كه در دسترس قرار دارد، نياز داشته باشد؛ (2) فردى ممكن است نيازمند تعيين تعداد و انواع ارگانيسم هاى حاضر در يك ماده معين باشد؛ یا (3) شخصى ممكن است بخواهد نوع خاصى از ميكروارگانيسم را از يك منبع طبيعى جدا كند.

 

الف) سلول هاى در حال رشد از يك گونه معين

ميكروارگانيسم هايى كه در طبيعت رشد مى نمايند، ممكن است رشد آنها به صورت كشت خالص در يك محيط مصنوعى بسيار دشوار باشد. براى مثال، برخى اشكال انگلى را نمى توان هيچگاه در خارج از بدن ميزبان كشت داد. با اين همه، در كل مى توان يك محيط مناسب را طراحى كرد كه در آن شريط طبيعى ارگانيسم در نظر گرفته شود. pH، درجه حرارت و هوا دهى را مىتوان به سهولت با محيط طبيعى همسان نمود؛ مشكل اصلى در خصوص نوتریئنت ها است. آنچه محيط زنده به ارگانيسم اعطا مى كند مهم بوده و تجزيه و تحليل آن دشوار مى باشد؛ يك انگل ممكن است نيازمند عصاره بافت ميزبان، و يك ارگانيسم آزاد زى ممكن است نيازمند يك ماده دفع شده توسط ميكروارگانيسمى كه در طبيعت با آن همنشين است، باشد. در راستاى تعيين نيازمندى هاى ارگانيسم بايد آزمايشاتى اساسى صورت گيرد، و موفقيت اين آزمون ها به تأمين هر يك از منابع مناسبى كه در آغاز اين فصل ذكر گرديد، بستگى دارد. كشت انگل هاى اجبارى نظير كلاميديا در فصل 27 به بحث گذاشته شده است.

 

ب) بررسى ميكروبيولوژيكى مواد طبيعى

يك ماده طبيعى معين ممكن است در بر گيرنده تعداد زيادى محيط كوچك متفاوت باشد كه هر كدام آشيانه اى را براى يك گونه ی متفاوت فراهم مى آورد. كشت دادن يك نمونه از ماده تحت يك سرى شرايط، اجازه ساخت كلنى را توسط يك گروه انتخابى از ارگانيسم ها خواهد داد، اما بسيارى از انواع ديگر ناديده انگاشته خواهند شد. به همين دليل، براى چنين نمونههايى معمولاً از محيط كشت هاى متفاوت و شرايط انكوباسيون مفيد استفاده مىگردد. چنانچه بيشتر اشكال موجود بايد شناسايى شوند، 8-6 شرايط مختلف كشت، تعدادى منطقى خواهد بود.

    از آنجايى كه هر نوع ارگانيسم حاضر در نمونه بايد شانس رشد داشته باشد، محيط هاى جامد استفاده گرديده و از ازدحام كلنى ها اجتناب به عمل مى آيد. در غير اين صورت، رقابت بين ارگانيسم ها باعث جلوگيرى از تشكيل برخى از انواع كلنى ها خواهد شد.

 

پ) جدا سازى يك نوع خاص از ارگانيسم

يك نمونه كوچك از خاك – چنانچه به درستى مديريت گردد – براى هر محيط كوچكى كه در آن وجود دارد، يك نوع متفاوت از ارگانيسم را ثمر خواهد داد. از خاك حاصلخيز (مرطوب، داراى هوا، و غنى از مواد معدنى و آلى) مى توان صد ها يا حتى هزاران نوع ميكروارگانيسم را جدا كرد. اين كار با انتخابى نمودن شرايط براى هر گونه ی مورد نظر، انجام مى شود. براى مثال، يك گرم خاك به يك بالون حاوى محيط مايع تلقيح مى شود كه به قصد يك نوع دلخواه از ميكروارگانيسم، براى مثال تثبيت كنندگان هوازى نيتروژن (ازتوباكتر) ايجاد گرديده است. در این مورد، به محیط نیتروژن افزوده نشده و به صورت هوازی انکوبه می گردد. چنانچه سلولها ى ازتوباكتر در خاك حضور داشته باشند، به خوبى در اين محيط رشد خواهند نمود؛ اشكالى كه قادر به تثبيت نيتروژن نيستند فقط تا حدى رشد خواهند كرد كه نيتروژن تثبيت شده ی خاك – كه به عنوان آلاينده به محيط وارد شده است – اجازه دهد. بنابراين، هنگامى كه ارگانيسم ها كاملاً رشد كردند، درصد ازتوباكتر در جمعيت كلى شديداً افزايش خواهد داشت؛ از اينرو، اين شيوه «كشت غنى» (enrichment culture) ناميده مى شود. انتقال يك نمونه از اين كشت به محيط تازه به تقويت يا غنى سازى بيشتر ازتوباكتر منتج مى گردد؛ پس از چند انتقال متوالى، مى توان كشت را روى يك محيط جامد برده و كلنى هاى ازتوباكتر را جدا نمود.

    حتى هنگامى كه نوع خاصى از ارگانيسم در خاك به تعداد اندكى در يك جمعيت ميليونى وجود دارد. از محيط کشت مایع استفاده می گردد تا اجازه رقابت و در نتیجه انتخاب بهینه داده شود. می توان از محیط «غنى طبيعى» (natural enrichment) بهـره بـرد. بـراى مثـال، در جستجوى اكسيد كنندگان نفت، خاك آلوده به نفت انتخاب مى شود، زيرا اين خاك از قبل يك محيط غنى براى چنين ميكروارگانيسم هايى است.

    بنابراين، كشت غنى فرآيندى است كه به موجب آن محيط كشت به نحوى آماده مى شود كه همسان با محيط طبيعى (زيستگاه) ميكروارگانيسم مورد نظر بوده و بدين طريق براى آن انتخابى باشد (شکل 5-5). يك اصل مهم درگير در چنين انتخابى عبـارت است از : ارگـانيسم انتخابى بـايد صرفاً حداقـل نيازمندى هاى غذايى اش برآورده شود. براى مثال، ازتوباكتر بهترين رشد را يك محيط حاوى نيتروژن آلى دارد، اما نياز حداقل اش حضور N2 است؛ بنابراين، اين ارگانيسم در يك محيط داراى N2 به عنوان تنها منبع نيتروژن، انتخابى مى گردد. اگر به محيط نيتروژن آلى اضافه شود، شرايط براى ازتوباكتر چندان انتخابى نيست، بلكه به جاى آن، براى ارگانيسمى كه نيتروژن آلى نيازمندى حداقل آن است انتخابى خواهد شد.

 

كلنى مجزا (تكى) - كشت پور يا پور - پليت - pour-plate technique - تكنيك كشت گسترده يا پهن - streak-plate technique - شمارش جمعيت ميكروبى  - spread plate technique -

شکل 5-5. كشت غنى. شرایط محیط و انکوباسیون برای رشد گونه های مطلوب در مقابل سایر باکتری ها در نمونه، مساعد می شود.

 

    به هنگام جستجوى نوع خاصى از ارگانيسم که بخشی از یک جمعیت مخلوط است، محیط های انتخابی یا افتراقی استفاده می شوند. محیط های انتخـابی (selective media) رشد ارگانیسم هـا به غیر از ارگـانیسم مطلوب را بـاز می دارند. برای مثال، تایِر - مارتین آگـار برای جـدا سازی نیسریا گونوره، عامل سوزاک، از نمونه های بالینی استفاده می شود. محیط های افتراقی (differential media) دارای ماده یا موادی اند که برخی باکتری ها آنها را در شیوه ای قابل تشخیص تغییر می دهند. براى مثال، كلنى هاى اشريشياكولى بر روى آگار حاوى رنگ هاى ائوزين و متلين بلو (EMB آگـار) خاصيت درخشش رنگيـن كمـانى دارند. همچنين، EMB آگارِ واجد غلظت بالايى از يك قند سبب مى شود تا ارگانيسم هاى تخميركننده آن قند كلنى هاى متمايل به قرمز را پديد آورند. محيط هاى افتراقى براى اهدافى همچون تشخيص حضور باكترى هاى رودهاى در آب يا شير و حضور برخى پاتوژن ها در نمونه هاى بالينى مورد استفاده اند. جدول 2-5 خصوصیات محیط های نمونه ی مورد استفاده برای کشت باکتری ها را ارائه می دهد.

 

 

جدول 2-5 خصوصیات محیط های نمونه ی مورد استفاده برای کشت باکتری ها

محیط

خصوصیات

بلاد آگار

محیط پیچیده ای که به طور روتین در آزمایشگاه های بالینی استفاده می شود. افتراقی، زیرا کلنی های ارگانیسم های همولیتیک توسط هاله ای شفاف از گلبول های قرمز احاطه می گردند. انتخابی نیست.

شکلات آگار

محیط پیچیده مورد استفاده برای کشت باکتری های مشکل پسند، به ویژه آنهایی که در نمونه های بالینی یافت می شوند. انتخابی یا افتراقی نیست.

گلوکز سالتز

محیطی به لحاظ شیمیایی تعریف شده. مورد استفاده در آزمایشات آزمایشگاهی برای مطالعه نیازمندی های تغذیه ای باکتری ها. انتخابی یا افتراقی نیست.

مک کانکی آگار

محیط پیچیده مورد استفاده برای جدا سازی باسیل های گرم منفی که معمولاً در روده وجود دارند. انتخابی، زیرا نمک های صفرا و        رنگ ها ارگانیسم های گرم مثبت و کوکوس های گرم منفی را مهار می سازند. افتراقی، زیرا شناساگر pH به هنگام تخمیر قند، لاکتوز، در محیط، به صورتی - قرمز تبدیل می گردد.

نوتریئنت آکار

محیط پیچیده مورد استفاده برای کار روتین آزمایشگاهی. از رشد انواعی از باکتری های غیر مشکل پسند حمایت می نماید. انتخابی یا افتراقی نیست.

تایر مارتین

محیط پیچیده مورد استفاده برای جدا سازی گونه های نیسریا، که مشکل پسند اند.  انتخابی، زیرا در بردارنده آنتی بیوتیک هایی است که اکثر ارگانیسم ها به استثنای گونه های نیسریا را مهار می سازند. افتراقی نیست.

 

جدا سازى ميكروارگانيسم ها در كشت خالص

به منظور مطالعه يك ارگانيسم معين، لازم است آن ارگانيسم در كشت خالص (pure culture) عارى از تمام ديگر انواع ارگانيسم ها بررسى شود. براى انجام اين عمل، يك سلول منفرد بايد از تمام سلول هاى ديگر جدا و به نحوى كشت داده شود كه سلول هاى مشترك حاصل از آن هم به صورت مجزا باقى بمانند. براى اين كار، چند روش وجود دارد.

 

الف) كشت در محيط جامد

برخلاف سلول هاى موجود در محيط مايع، سلول هاى موجود درون محيط ژله اى يا روی آن غیر متحرک هستند. بنابراین، اگر تعداد کم و کافی سلول ها روی محیط ژله ای یا درون آن قرار داده شوند، هر سلول به شكل يك كلنى مجزا (تكى) رشد خواهد نمود. يك عامل ژله كننده ی ايده آل براى اكثر محيط هاى ميكروب شناسى آگار مى باشد كه يك پلى ساكاريد استخراج شده از برخى جلبك هاى قرمز است. یك سوسپانسيون 2-5/1 درصد آگار در آب، در دماى °C100 حل مى شود و به شكل یك محلول شفاف در مى آيد، كه در دماى °C45 حالت ژله اى به خود مى گيرد. بنابراين، يك محلول آگار استريل را مى توان تا دماى دماى °C50 سرد نمود و باكترى ها يا ساير سلول هاى ميكروبى را به آن افزود و آنگاه محلول را به سرعت در پايين تر از دمـاى °C45 سرد كرد و بـه حـالت ژله اى دست يافت (هر چند، اغلب سلول هاى ميكروبى در دماى °C50 كشته خواهند شد، اما اين دوره زمانى به اندازه اى كوتاه است كه اجازه انجام اين فرآيند را بدهد؛ شكل 3-4 را ببينيد). پس از آن كه آگار به صورت ژل در آمد، دوباره به حالت مايع تبديل نخواهد شد، مگر آن كه تا بالاتر از دماى °C80 حرارت داده شود. بنابراين، متعاقباً مى توان از هر دمايى كه براى انكوباسيون كشت ميكروبى مناسب است، استفاده نمود. در فرآيندى موسوم به كشت پور يا پور - پليت (pour-plate technique؛ ريختن = pour)، سوسپانسيونى از سلول ها با آگارِ ذوب گشته در دماى °C50 مخلوط مى گردد و سپس به درون يك ديش پِترى ريخته مى شود. پس از جامد شدن آگار، سلول ها در آن بى حركت شده و به شكل كلنى رشد مى نمايند. چناچه سوسپانسيون سلولى به اندازه كافى رقيق باشد، كلنى ها به خوبى مجزا خواهند شد، و بنابراین به احتمال زياد هر كدام از يك سلول واحد منشأ می گیرند (شكل 6-5). اگرچه، براى اطمينان حاصل كردن از اين موضوع، لازم است تا يك كلنى از نوع مورد نظر برداشته شده، در آب سوسپانسيون گردد، و كشت مجدد آن انجام گيرد. تكرار اين فرآيند در چند مرحله، به دست آوردن كشت خالص را تضمين مى نمايد.

    به طور جايگزين، سوسپانسيون اوليه را مى توان به كمك يك حلقه سيمى (لوپ) بـر روى پليت آگـار، به صورت خطى كشت داد (streak-plate technique). همچنان كه كشيدن خطوط روى پليت ادامه مى يابد، سلول هاى كمتر و كمترى بر روى لوپ باقى مى مانند، و در نهايت، لوپ ممكن است سلول هاى منفرد را بر روى آگار به جاى بگذارد (7-5). پليت انكوبه مى گردد، و سپس هر كلنى اى كه به خوبى مجزا (تكى) شده باشد، برداشته مى شود و سوسپانسيون مجدد آن صورت مى پذيرد، و بار ديگر بر روى آگار كشت خطى داده مى شود. اگر يك سوسپانسيون (و نه فقط كمى از رشد گرفته شده از يك كلنى يا اسلنت) بر روى پليت آگار به صورت خطى كشت گردد، اين شيوه به اندازه روش پور - پليت و سريع تر از آن، قابل اطمينان خواهد بود.

    در تكنيك كشت گسترده يا پهن (spread plate technique)، حجم اندكى از سوپانسيون ميكروبىِ رقيق شده كه از حدود 300-30 سلول برخوردار است، به مركز يك پليت آگار انتقال مى يابد و به كمك يك ميله شيشه اى خميده ی استريل به طور صاف در روى سطح آگار گسترانيده مى شود. سلول هاى پراكنده شده به كلنى هاى تكى توسعه پيدا مى كنند.  به دليل آنكه تعداد كلنى ها بايد معادل تعداد ارگانيسم هاى زنده در نمونه باشد، از كشت پهن مى توان براى شمارش جمعيت ميكروبى استفاده نمود.

 

 شكل 6-5. تكنيك پور - پليت. نمونه اوليه چندين مرتبه رقيق مى شود تا جمعيت ميكروبى به اندازه كافى كم تراكم گردد. آنگاه، نمونه هايى كه بالا ترين رقت را دارند با آگار گرم مخلوط و به درون ديش هاى پترى ريخته مى شوند. سلول هاى تكى به شكل كلنى رشد نموده و براى ايجاد كشت هاى خالص مورد استفاده قرار مى گيرند. كلنى هاى سطحى دايره اى شكلاند؛ كلنى هاى زير سطحى عدسى شكل مى باشند.

 

شكل 7-5. تكنيك كشت خطى.: A  الگوى معمول خط كشى.: B   مثالى از يك كشت خطى.

 

ب) رقت

 

يك روش كمتر قابل اعتماد، رقتِ از ميان رونده است. سوسپانسيون به طور متوالى رقيق مى شود، و نمونه هاى هر رقت كشت مى گردند. چنانچه تنها نمونه هاى اندكى از يك رقت بخصوص رشد را نشان دهند، فرض مى شود كه بعضى از كلنى ها از سلول های منفرد شروع شده اند. اين شيوه مورد استفاده قرار نمى گيرد، مگر آنكه كشت دادن بر روى پليت به هر دليلى امكان پذير نباشد: يك خصوصيت نامطلوب اين روش آن است كه تنها مـى تواند بـراى جـدا سـازى نوع غـالب ارگـانيسم در يـك جمعيت مخلوط به كـار رود.

 

خلاصه فصل

  • ارگانیسم ها به منظور رشد، به تمامی عناصر حاضر در ماده آلیِ خود و دسته کاملی از یون های لازم برای انرژی نیاز دارند. نوتریئنت ها بر حسب عناصری که تأمین می کنند، تقسیم بندی شده، عبارتند از : منبع کربن، منبع نیتروژن، منبع گوگرد، و منابع معدنی.
  • فاکتور های رشد، ترکیباتی آلی اند که سلول جهت رشد باید آنها را داشته باشد، اما قادر به سنتز آنها نیست.
  • برای برقراری نیروی محرکه پروتون و اجازه سنتز ماکروملکولی، باید منبعی از انرزی حاضر باشد. سه مکانیسم اصلی برای تولید انرژی متابولیکی، تخمیر، تنفس، و فتوسنتز هستند.
  • فاکتور های محیطی، نظیر pH، دما، و هوا  دهی جهت رشد حائز اهمیت اند. اکثر پاتوژن های انسانی نوتروفیل (بهترین رشد در 0/8-0/6=pH) و مزوفیل (بهتری رشد در دمای C°37-30)  می باشند.
  • ارگانیسم ها در توانایی استفاده از اکسیژن به عنوان پذیرنده هیدروژن و در توانایی غیر فعال ساختن محصولات فرعیِ سمی از متابولیسم هوازی، کاملاً فرق دارند. آنها ممکن است در قالب هوازی های اجباری، بی هوازی های اختیاری، بی هوازی های اجباری، میکروآئروفیل هـا، و بی هوازی هـای آئـروتولرانت گروه بندی شوند.
  • محیط های میکروبیولوژیکی می توانند فرموله شوند تا اجازه رشد نوع به خصوصی از میکروارگانیسمِ حاضر در تعداد اندک را بدهند (کشت غنی)، انواع خاصی از میکروارگانیسم ها را بشناسند (محیط افتراقی)، یا یک ارگانیسم خاص را از یک جمعیت مخلوط جدا سازند (محیط انتخابی).

 

پرسش هاى مرورى

1. اكثر ميكروارگانيسم هاى بيماري زا براى انسان در كدام دماى انكوباسيون بهترين رشد را در آزمايشگاه دارند؟

الف) C°20-15

ب) C°30-20

پ) C°37-30

ت) C°50-38

ث) C°55-50

 

2. فرآيندى كه در آن ميكروارگانيسم ها ATP را در جريان تخمير گلوكز شكل مى دهند به واسطه كدام مورد زير مشخص مى گردد؟

الف) زوج شدن توليد ATP با انتقال الكترون ها

ب) دنيتريفيكاسيون

پ) احياى اكسيژن

ت) فسفريلاسيون سوبسترا

ث) تنفس بى هوازى

 

3. كدام يك از تكنيك ها و محيط هاى كشت زير مى تواند بيشترين تعداد گونه هاى ميكروبى را در يك نمونه خاك مورد شمارش قرار دهد؟

الف) كشت غنى

ب) يك پليت از محيط انتخابى

پ) يك پليت از محيط افتراقى

ت) يك لوله نوتريئنت براث

ث) يك تعداد محيط و شرايط انكوباسيون متفاوت

 

4. پليمريزاسيون قطعات ساختمانى (مانند اسيد هاى آمينه) به ماكروملكول ها (مانند پروتئين ها) عمدتاً با كدام مورد زير به دست مى آيد؟

الف) دهيدراسيون

ب) احيا

پ) اكسيداسيون

ت) جذب

ث) هيدرليز

 

5. يك سويه اشريشياكولى متحمل يك جهش شده است، به نحوى كه نمىتواند در يك محيط تعريف شده حاوى گلوكز، نمك هاى معدنى، و كلريد آمونيوم رشد نمايد. هرچند، اگر به اين محيط متيونين افزوده شود، اين سويه قادر به رشد خواهد بود. متيونين تحت چه عنوانى اشاره مى گردد؟

الف) يك نمك معدنى

ب) يك منبع گوگرد

پ) يك فاكتور رشد

ت) يك منبع انرژى

ث) يك منبع نيتروژن

 

6. کدام یک از موارد زیر یک مکانیسم تولید انرژی متابولیکی توسط میکروارگانیسم شمرده نمی شود؟

الف) تخمیر

ب) سنتز پروتئین

پ) تنفس

ت) فتوسنتز

ث) پ و ت

 

7. کدام یک از اصطلاحات زیر بهترین توصیف برای میکروارگانیسمی است که در دمای C°20 رشد می کند؟

الف) نوتروفیل

ب) سایکروتروف

پ) مزوفیل

ت) اسموفیل

ث) ترموفیل

 

8. توانایی جذب 2N به طور احیا از 3NH چه نام دارد؟

الف) آمونیفیکاسیون

ب) آناموکس

پ) احیای جذبی نیترات

ت) دآمیناسیون

ث) تثبیت نیتروژن

 

9. کدام یک از موارد زیر توسط یک سلول یوکاریوتی جذب نمی گردد؟

الف) گلوکز

ب) لاکتوز

پ) سولفات (-42SO)

ت) نیتروژن (2N)

ث) فسفات (-42PO)

 

10. باکتری هایی که پاتوژن های درون سلولیِ اجباریِ انسان ها هستند ( مانند کلامیدیا تراکوماتیس) کدام مورد محسوب می شوند؟

الف) اتوتروف

ب) فتوسنتتیک

پ) شیمیو لیتوتروف

ت) هایپر ترموفیل

ث) هتروتروف

 

پاسخ ها

1- پ

2- ت

3- ث

4- الف

5- پ

6- ب

7- ب

8- ث

9- ت

10- ث

 

 

 
 
برای مطالعه سایر فصل های کتاب میکروب شناسی پزشکی جاوتز (جهاندیده و جهاندیده) بر روی فهرست کتاب کلیک نمائید.
 

 


كشت ميكروارگانيسم ها , غلظت نمك , قدرت يونى محيط كشت , نيازمندى هاى رشد , پيوند هاى آنيدريد (anhydride bonds) , نيروى محركه پروتون , proton motive force , شيب الكتروشيميايى , pH (غلظت يون هيدروژن) , منابع انرژى متابوليكى , تخمير، تنفس و فتوسنتز , تخمير , تشكيل ATP , فسفريلاسيون سوسبسترا , ADP (آدنوزین دی فسفات) , ملكول گلوكز (C6H12O6) , مسير امبدن ـ ميرهوف , اسيد لاكتيك (C3H6O3) , فتوسنتز , نوتريئنت ها (مواد غذايى) , منبع كربن , رشد تخميرى يا تنفسى , منبع نيتروژن , يون آمونيوم (NH4+) , تثبيت نيتروژن , nitrogen fixation , آمين ها (R, NH2) , اسيد هاى آمينه (RCHNH2COOH) , نيترات (NO3, ) , نيتريت (NO2, ) , احياى جذبى نيترات , assimilatory nitrate reduction , احياى جذبى نيتريت , assimilatory nitrite reduction , سوخت (dissimilation) , باكترى هاى اتوتروف , نيتروزوموناس , نيتروباكتر , فرآيند دنيتريفيكاسيون , واكنش آناموكس (anammox) , منبع گوگرد , Pi , سولفيد هيدروژن (H2S) , فسفات غير آلىِ آزاد , inorganic phosphate free , منابع معدنى , هيدروكسامات ها (, CONH2OH) , سيدرامين ها , مشتقات كاتِكول , دى هيدروكسى بنزوئيل سرين , فاكتور هاى رشد , growth factor , عناصر کمیاب , trace elements , غلظت يون هيدروژن (pH) , نوتروفيل ها , اسيدوفيل ها , آلكاليفيل ه , نوتروفيل ها (خنثى دوست ها) , آلكاليفيل ها (قلیایی دوست ها) , اشكال سايكروفيل (سرما دوست) , اشکال ترموفيل (گرما دوست) , هايپرترموفيل (شديداً گرما دوست) , پاسخ شوك حرارتى , heat, shock response , پروتئين هاى شوك حرارتى , قدرت يونى و فشار اسمزى , فشار اسمزى , غلظت نمك , اسموفيل (فشار اسمزى دوست) , اسمولاريته (حالت اسمزى) , محيط كشت , بررسى ميكروبيولوژيكى مواد طبيعى , جدا سازى يك نوع خاص از ارگانيسم , تثبيت كنندگان هوازى نيتروژن (ازتوباكتر) , كشت غنى , enrichment culture , محیط غنى طبيعى , natural enrichment , محیط های انتخـابی , selective media , محیط های افتراقی , differential media , ائوزين و متلين بلو , EMB آگار , جدا سازى ميكروارگانيسم ها در كشت خالص , كشت خالص , pure culture , كشت در محيط جامد , كلنى مجزا (تكى) , كشت پور يا پور , پليت , pour, plate technique , تكنيك كشت گسترده يا پهن , streak, plate technique , شمارش جمعيت ميكروبى , spread plate technique ,

نام و نام خانوادگی:
متن:
تصویر:

نظرات و پیشنهادات

عضویت در سایت

پشتیبانی آنلاین

نام و نام خانوادگی:
پست الکترونیک:
متن:

نام کاربری:
کلمه عبور:
کلمه عبور را بخاطر بسپار
کلمه عبور خود را فراموش کرده ام
عضویت در سایت

نام و نام خانوادگی:
پست الکترونیک:
شماره موبایل:
گفتگو با:


کتاب دانلود : دانلود کتاب های علمی و دانشگاهی روز دنیا. هرگونه کپی برداری از محتوا، قالب، و طرح های به کار رفته در این سایت شرعا و قانونا ممنوع می باشد، و پیگرد قانونی دارد.