جستجو در کتاب ها   جستجو در مقالات   جستجو در کل سایت
تاریخ ثبت : دوشنبه 3 تير 1398 ساعت 15 : 1     میکروب شناسی جاوتز
بخش 7 ميكروب ‌شناسي پزشكي تشخيصي و ارتباط باليني - فصل 47 اصول ميكروب ‌شناسي پزشكي

فصل 47  اصول ميكروب ‌شناسي پزشكي

 

برای مطالعه سایر فصل های کتاب میکروب شناسی پزشکی جاوتز

(جهاندیده و جهاندیده)

بر روی فهرست کتاب

کلیک نمائید.

 

 

ميكروب ‌شناسي پزشكيِ تشخيصي با تشخيص اتيولوژيك (علت شناسی) عفونت ارتباط دارد. فرآيندهاي آزمايشگاهي مورد استفاده در تشخيص بيماري عفوني در انسان‌ ها شامل موارد زير است :

 

  1. شناسایی مورفولوژيك عامل در رنگ آمیزی ‌هاي نمونه ‌ها یا مقاطع بافت (بررسي با ميكروسكوپ ‌هاي نوري و الكتروني).
  2. جداسازي و شناسايي عامل در كشت.
  3. يافتن آنتي ژن عامل از طريق سنجش ايمونولوژيك (لاتكس آلگوتيناسيون، ‌آنزيم ايمونواسي [EIA]، و غيره) يا از طريق رنگ ‌آميزي آنتي باديِ نشان دار شده با فلئورسئين (يا نشان دار شده با پراكسيداز).
  4. هيبريديـزاسيـون DNA-DNA يا DNN-RNA به منظور پي بردن به ژن‌ هاي اختصاصي در نمونه‌ هاي بيماران.
  5. تشخيص و تقويت اسيد نوكلئيك ارگانيسم در نمونه‌ هاي بيماران.
  6. اثبات آنتي بادي معني ‌دار يا پاسخ‌ هاي ايمني با واسطه سلول نسبت به يك عامل عفونت ‌زا.

 

    در زمينه بيماري ‌هاي عفوني، نتايج آزمون‌ هاي آزمايشگاهي تا حد زيادي به كيفيت نمونه، زمان جمع ‌آوري، و دقت در آن، و مهارت هـاي فني و تجربيات كاركنان آزمايشگاه بستگي دارد. اگرچه پزشكان بايد براي انجام چند آزمون ميكروبيولوژيك ساده و بسيار مهم – ساخت و رنگ‌ آميزي اسمير، بررسي آن به طور ميكروسكوپي، و كشت خطي روي پليت – داراي سر رشته باشند، جزئيات فني فرآيند هاي درگير تر معمولاً بر عهده باكتري شناس يا ويروس‌ شناس و تكنیسين ‌ها باقي مي‌ ماند. پزشكاني كه با فرآيند هاي عفوني سر و كار دارند، ‌بايد بدانند كه چه هنگام و چگونه نمونه ‌برداري كنند، و اين كه چه بررسي ‌هاي آزمايشگاهي ‌اي بايد درخواست شود، و نتايج چگونه بايد تفسير گردند.

    اين فصل در خصوص ميكروب ‌شنـاسي تشخيصي باكتريايي، قارچي، كلاميديايي، و بيماري ويروسي به بحث مي ‌پردازد. تشخيص عفونت ‌هـاي انگلي در فصل 46 بحث شده است.

 

ارتباط ميان پزشك و آزمايشگاه

ميكروب ‌شناسي تشخيصی ويژگي ‌هاي هزاران عامل مسبب بيماري ‌هاي عفوني يا مرتبط با بيماري ‌هاي عفوني را توصيف مي ‌نمايد. تكنيك ‌هاي مورد استفاده براي توصيف عوامل عفونت زا تا حد زيادي بر اساس سندرم باليني و نوع عامل – ويروس، باكتري، ‌قارچ، يا انگل – متفاوت هستند. از آنجايي كه هيچ آزمون منفردي اجازه جدا سازي يا توصيف پاتوژن ‌هاي بالقوه را نمي‌ دهد، اطلاعات باليني براي ميكروب ‌شنـاسي تشخيصي به مـراتب مهم‌ تر اند تا براي شيمي باليني يا هماتولوژي. پزشك به جاي آن كه تا رسيدن نتايـج آزمايشگاه منتظر بماند، بايـد به يك تشخيص تجـربي برسد. به هنگام درخواست آزمايشات، پزشك بايد كاركنان آزمايشگاه را از تشخيص تجربي خود (نوع عفونت يا عامل عفونت ‌زاي مشكوك) آگاه سازد. برچسب زدن مناسب نمونه هـا، اين قبيل داده‌ هـاي باليني، به علاوه داده ‌هـاي تشخيصي بيمار (دست كم دو شيـوه از شناسايـي قطعي) و نـام پزشك درخواست دهنده و اطلاعات تماس بيمار را شامل مي ‌شود.

    بسياري از ميكروارگانيسم ‌هاي پاتوژن به آهستگي رشد مي‌ كنند، و پيش از جدا سازي و شناسايي آنها ممكن است چند روز يا حتي چند هفته زمان سپري شود. پس از اخذ نمونه‌ هاي مناسب، اطلاع‌ رساني آزمايشگاه از تشخيص باليني تجربي، پزشك بايد درمـان را با دارو هـايي آغاز نمايد كه ارگانيسمي را كـه تصور مي ‌شود مسئول بيماري است، مورد حذف قرار دهند. همچنان كه كاركنان آزمايشگـاه به دست آوردن نتايـج را شروع مي‌ كنند، آنها ارائـه دهندگان مراقبت‌ هـاي بهداشتي را آگاه مي ‌سازنـد، و آنگاه اين افـراد مي ‌توانند در تشخيص و سيـر باليني بيمار تجديد نظر كنند و شايـد در برنامه درماني تغييرات ايجاد نمايند. اين اطلاعات "بازخورد" از آزمايشگاه شامل گزارشات اوليـه ‌ي نتايج هر مرحله در جـدا سازي و شناسايـي عامل مسبب است.

 

تشخيص عفونت ‌هاي باكتريايي و قارچي

نمونه ‌ها

بررسي آزمايشگاهي معمولاً مطالعه ميكروسكوپي مواد تازه‌ي رنگ‌آميزي شده يا رنگ‌آميزي نشده و آماده ‌سازي كشت‌ ها با شرايط مناسب براي رشد طيف گسترده ‌اي از ميكروارگانيسم ‌ها، از جمله نوع ارگانيسمي كه به احتمال زياد بر مبناي شواهد باليني، مسبب بيماري است، را شامل مي‌ شود. چنانچه يك ميكروارگانيسم جدا گردد، آنگاه شناسايي كامل آن ممكن است پي‌گيري شود. هنگامي كه پاتوژن ‌هـاي مهم قبل از درمان جدا گردند، بررسي ‌هاي پي‌ گيرانه‌ي آزمايشگاهي در طول درمان و بعد از آن ممكن است مناسب باشد.

    نمونه ‌اي كه به درستي جمع‌ آوري شده است مهم ‌ترين گام در تشخيص عفونت به شمار مي ‌رود، زيرا نتايج آزمون‌ هاي تشخيصي براي بيماري‌ هاي عفوني به انتخاب، زمان، و شيوه جمع ‌آوري نمونه ‌ها بستگي دارد. باكتري ‌ها و قارچ‌ ها رشد مي ‌كنند و مي ‌ميرند، ‌و در برابر بسياري از مواد شيميايي حساس ‌اند، و مي ‌توانند در جايگاه‌ هاي آناتوميك مختلف و مايعات بدني و بافت‌ هاي متفاوت در طول دوره بيماري‌ هـاي عفوني يافت شوند. از آنجا كه جدا سازي عامل در رسیدن به يك تشخيص بسيار مهم است، نمونه بايد از جايگاهي به دست آيد كه به احتمال زياد در مرحله خاصي از بيماري، آن عامل را در بر داشته باشد، و بايد به نحوي گرفته شود که به بقا و رشد عامل آسيـب نرساند. بـراي هر نـوع از نمونه، پيشنهـادات جهت كار بهينـه، در پاراگراف‌ هـاي زير و در بخش بعدي، در تشخيص با جايگاه آناتوميك، ارائـه گرديده ‌اند.

    چنانچـه عامل از جايگاهي جـدا شود كه بـه طور طبيعي عـاري از ميكروارگانيسم ‌ها (به طور طبيعي استريل)‌ باشد، برداشت باكتري‌ها و قارچ‌ها بيشترين اهميت را دارد. هر نوع ميكروارگانيسم كشت شونده از خون، مايع مغزي نخاعي، مايع مفصلي، حفره جنب، يا حفره صفاق يك یافته تشخيصي قابل توجه است. در مقابل، بسياري از نقاط‌ بدن از ميكروبيوتاي نرمال برخوردار اند (فصل 10)، كه ممكن است با اثرات اندوژن يا اگزوژن تغيير يابند. برداشت پاتوژن‌ هاي بالقوه از دستگاه تنفس، دستگاه گوارش،‌ يا دستگاه ادراري تناسلي؛ از زخم‌ها؛ يا از پوست بايد در محتواي ميكروبيوتاي نرمال هر يك از جايگاه‌ هاي خاص در نظر گرفته شود. داده‌ هاي ميكروبيولوژيكي بايد به منظور رسيدن به يك تفسير معني‌ دار از نتايج،‌ با اطلاعات باليني مرتبط باشند.

    چند قانون كلي براي همه نمونه‌ ها اعمال مي ‌شود :

 

  1. مقدار ماده بايد كافي باشد.
  2. نمونه بايد بيانگر فرآيند عفوني باشد (براي مثال، ‌خلط، نه بزاق؛ چرك از ضايعه زمينه ‌اي، نه از مجراي سينوس آن؛ سوآب از عمق زخم، نه از سطح آن).
  3. تنها با بهره‌ گيري از تجهيزات استريل و اقدامات احتياطيِ آسپتيك،‌ بايد از آلودگي نمونه اجتناب شود.
  4. نمونه بايد در آزمايشگاه گرفته شود و بي ‌درنگ مورد بررسي قرار گيرد. محيط‌ هاي انتقال ويژه ممكن است كمك كننده باشند.
  5. نمونه ‌هاي معني ‌دار براي تشخيص عفونت ‌هاي باكتريايي و قارچي بايد پيش از تجويز دارو هاي ضد ميكروبي گرفته شوند. چنانچه دارو هاي ضد ميكروبي قبل از گرفتن نمونه‌ هاي لازم براي مطالعه ميكروبيولوژيك، تجـويز شده باشند، درمـان دارويي ممكن است متوقف گـردد و به دست آوردن نمونه‌ هـا چند روز بعد تكرار شود.

 

    نوع نمونـه ی مـورد بررسي بر اساس تصويـر بالينيِ ارائـه شده تعيين  مي ‌گردد. چنانچه علائم يا نشانه‌ ها به درگيري يك سيستم عضو اشاره داشته باشند، نمونه ‌ها از آن منبع به دست مي ‌آيند. در غياب نشانه ‌ها يا علائم موضعي، نخست نمونه ‌هاي تكراري خون براي كشت گرفته مي ‌شوند، و سپس در ادامه بر اساس احتمال درگيري يك سيستم عضو معين در يك بيماري يا بـر اساس سهولت به دست آوردن نمونه‌ هـا، از ديگـر جايگاه‌ هـا نمونه ها برداشت مي‌گردند.

 

بررسي با ميكروسكوپ و رنگ ‌آميزي ‌ها

بررسي ميكروسكوپي نمونه ‌هاي رنگ ‌آميزي شده يا رنگ ‌آميزي نشده نسبتاً ساده و كم هزنيه است، اما براي شناسايي تعداد اندكي از باكتري ‌ها حساسيت آن‌ به مراتب كمتر از كشت مي ‌باشد. يك نمونه بايد دست كم حاوي 105 ارگانيسم در هر ميلي ‌ليتر باشد، تا احتمالاً ارگانيسم‌ ها در يك اسمير ديده شوند. محيط مايع حاوي 105 ارگانيسم در هر ميلي ‌ليتر با نگاه كردن، كدر به نظر نمي ‌رسد. نمونه‌ هاي حاوي 103-102 ارگانيسم در هر ميلي ‌ليتر رشد را بر روي محيط‌ هاي جامد ايجاد مي‌كنند،‌ و نمونه‌ هاي حاوي 10 باكتري يا كمتر در هر ميلي ‌ليتر ممكن است رشد را در محيط ‌هاي مايع به وجود آورند.

    رنگ ‌آميزي گرم روشي بسيار سودمند در ميكروبيولوژي تشخيصي است. اكثر نمونه ‌هاي مشكوك به عفونت باكتريايي بايد بر روي لام‌ هاي شيشه‌اي با رنگ ‌آميزي گرم، و به طور ميكروسكوپي بررسي شوند. مواد و روش رنگ ‌آميزي گرم در جدول 1-47 ذگر گرديده ‌اند. در بررسي ميكروسكوپي، واكنش گرم (آبي ارغواني بيانگر گرم مثبت، قرمز بيانگر گرم منفي) و مورفولوژي باكتري‌ ها (شكل : كوكوس، باسيل، فوزيفُرم، يا ساير؛ فصل 2 را ببينيد) بايد مورد توجه قرار گيرند. علاوه بر اين، وجود يا عدم وجود سلول‌ هاي التهابي و نوع سلول مهم است كه توجه و سنجيده شود. همچنين، حضور موادي كه به نظر نمي ‌رسد التهابي باشند، مانند سلول ‌هاي سنگفرشي اپيتليالِ به دست آمده از يك نمونه تنفسي يا زخم، ممكن است در تعيين كافي بودن جمع ‌آوري نمونه سودمند باشد. نماي باكتري ‌ها در اسمير هاي رنگ ‌آميزي شده گرم اجازه شناسايي گونه‌ ها را نمي ‌دهد. گزارش ‌ها از كوكوس‌ هاي گرم مثبت در قالب زنجيره‌ ها پيشنهاد بر گونه‌ هاي استرپتوكوكي مي‌ دهند، اما قطعي نيستند؛ كوكوس ‌هاي گرم مثبت به صورت خوشه ‌اي پيشنهاد دهنده گونه‌ هاي استافيلوكوكي مي ‌باشند. باسيل ‌هاي گرم منفي مي ‌توانند بزرگ، كوچك، يا حتي به شكل كوكوباسيلوس باشند. برخي از باكتري ‌هاي گرم مثبت غير زنده مي ‌توانند به عنوان گرم منفي رنگ بپذيرند. به طور معمول، مورفولوژي باكتريايي با استفاده از ارگانيسم‌هاي رشد يافته روي آگار شناسايي مي ‌شود. اگرچه، باكتري‌ ها در مايعات بدني يا بافت ‌ها مي‌ توانند مورفولوژي بسيار متنوعي داشته باشند.

    نمونه‌ هايي كه به منظور بررسي مايكوباكتريوم ‌ها ارسال مي گردنـد، بايد براي ارگانيسم‌ هاي اسيد - فست رنگ ‌آميزي شوند. حسا‌س ‌ترين رنگ ‌هاي فلئورسنت، مانند اورامين - روادمين،‌ بايد براي شناسايي مايكوباكتريـوم‌ هـا به كار روند. تأييد يك رنگ‌ آميزي فلئورسنت - مثبت معمولاً به كمك يكي از رنگ ‌آميزي‌ هاي اسيد - فست غير فلئورسنت، مانند رنگ‌ آميزي زيل -نلسون يا رنگ ‌آميزي كنييون انجام مي ‌گيرد (جدول 1-47). اين رنگ ‌آميزي‌ ها مي ‌توانند به عنوان جايگزين‌ هاي رنگ ‌آميزي ‌هاي فلئورسنت براي مايكوباكتريوم‌ها در آزمايشگاه‌هاي فاقد ميكروسكوپ فلئورسنت استفاده شوند. (فصل 23 را ببينيد). رنگ ‌آميزي ايمونو فلئورسنت آنتي بادي (IF) در شناسايي بسياري از ميكروارگانيسم ‌ها سودمند است. چنين روشي از ديگر تكنيك ‌هـاي رنگ ‌آميزي اختصاصي‌ تر مي‌ باشد، امـا همچنين انجـام آن  پر زحمت ‌تر است. آنتي بادي‌ هـای نشان دار شده با فلئورسئيـن در استفاده رايج، از آنتي سرم‌ هـاي توليد شده در اثر تزريق ارگانيسم‌ هـاي كامل يـا مخلوط‌ هاي پيچيده آنتي ‌ژن به حيوانات ساخته مي ‌شوند. آنتي بادي ‌هـاي پلي كلونال حاصله ممكن است با آنتي ‌ژن‌ هاي متعددِ مستقر در ارگانيسمي كه تزريق شده بود واكنش دهند و همچنين ممكن است با آنتي ‌ژن ‌هاي ساير ميكروارگانيسم ‌‌ها يا احتمالاً با سلول ‌هاي انساني در نمونه، واكنش متقاطع داشته باشند. براي به حداقل رساندن رنگ ‌آميزي غير اختصاصي IF كنترل كيفيت مهم است. استفاده از آنتي ‌بادي ‌هـاي مونوكلونال ممكن است مشكل رنگ ‌آميزي غير اختصاصي را دور بزند. رنگ‌آميزي IF در تأييد حضور ارگانيسم‌ هـاي اختصاصي نظير بوردتلا پرتوسيس يا لژيونلا پنوموفيلا در كلني ‌هاي جدا شده روي كشت بسيار سودمنـد مي‌ باشد. استفاده از رنگ ‌آميزي مستقيم IF روي نمونه‌ هاي گرفته شده از بيماران دشوار تر است و اختصاصيت كمتري دارد و تكنيك ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك يا NAAT ها (nucleic acid amplification techniques) تا حـد زيـادي جايگزين آن شده‌ اند.

    رنگ‌ هايي مانند كالكوفلئور وايت، متنامين سيلور و گاهي اوقات اسيد - شيف دوره‌اي يا PAS (periodic acid-Schiff) و سايرين براي بافت‌ها و نمونه‌ هاي ديگري كه در آنها قارچ‌ ها يا انگل ‌ها حضور دارند، به كار برده مي ‌شوند. چنين رنگ‌هايي براي ميكروارگانيسم‌هاي معين اختصاصي نيستند، اما آنها ممكن است ساختار را مشخص سازند، ‌به نحوي كه معيار هاي مورفولوژيك بتوانند براي شناسايي مورد استفاده قرار گيرند. كالكوفلئور وايت به سلولز و كيتين در ديواره سلولي قارچ‌ها اتصال مي‌يابد و تحت نور فرابنفش با طول مـوج بلند، فلئورسنس است. اين ويـژگي ممكن است مورفولوژي را نشان دهد كه براي گونه ‌ها ارزش تشخيصي دارد (مانند اسفرول ‌هـا با اندوسپور ها در عفونت كوكسيديوئيدس ايميتس). كيست ‌هاي پنوموسيستيس جيرووسي از نظر مورفولوژيكي در نمونه‌هاي رنگ ‌آميزي شده با نقره (سيلور) شناسايي مي ‌گردنـد. PAS براي رنگ ‌آميزي متقاطع بافتي، به هنگام مشكوك بودن به عفونت قارچي استفاده مي ‌شود. پس از جدا سازي اوليه قارچ ‌ها، رنگ ‌هايي نظير لاكتو فنل كاتِن بلو براي تشخيص رشد قارچي و شناسايي ارگانيسم‌ ها به واسطه مورفولوژي آنها استفاده مي‌ شوند.

    نمونه‌ هاي مورد بررسي براي قارچ‌ ها را مي ‌توان پس از مواجهه با محلول هيدروكسيد پتاسيم 10%، بدون رنگ بررسي كرد. هيدروكسيد پتاسيم بافت پيرامون میسليوم‌ هاي قارچي را شكسته، اجازه مي ‌دهد تا ديد بهتري از اشكال هيفي به دست آيـد. ميكروسكوپ اختلاف ‌فـاز برخي مواقع براي نمونه‌ هاي رنگ ‌آميزي نشده سودمند است. ميكروسكوپ زمينه تاريك براي يافتن تريپانوزوما پاليـدوم از ضايعات سفيلسي اوليه يا ثانويه يا سايـر اسپيروكت ‌ها نظير لپتوسپيرا سودمند مي ‌باشد.

 

سيستم ‌هاي كشت

براي باكتري ‌شناسي تشخيصي، به ويژه هنگامي كه ارگانيسم‌ هـاي احتمالي شامل باكتري ‌هـاي موازي، بي ‌هوازي اختياري و بي‌ هوازي اجباري باشند، به كارگيري چند نمونه محيط جهت كشت روتين لازم است. نمونه‌ هـا و محيط ‌هاي كشت مورد استفاده براي تشخيص عفونت‌ هاي باكتريايي شايع‌تر در جدول 2-47 ذكر گرديده‌ اند. محيط استاندارد براي نمونه ‌ها، بلاد آگار است، كه معمولاً با 5% خون گوسفند ساخته مي ‌شود. شكلات آگار، يك محيط حاوي خون حرارت ديده با مكمل ‌ها يا بدون آنها، دومين محيط لازم محسوب مي‌ شود؛ برخي ارگانيسم‌ ها كه بر روي بلاد آگار رشد نمي ‌كنند، از جمله نيسريا و هموفيلوس پاتوژن، بر روي شكلات آگار رشد خواهند نمود. محيط انتخابي براي باسيل‌ هاي گرم منفي روده ‌اي (مك كانكي آگار يا ائوزين - متيلن بلو [EMB] آگار) نوع سوم از محيطي است كه به طور روتين استفـاده مي ‌شود. نمونه ‌هـايي كه براي بي ‌هوازي‌ هـاي اجبـاري كشت  مي ‌گردند، ‌بايد دست كم بر روي دو نوع ديگر از محيط‌ ها، از جمله بر روي آگار بسيار مكمل دار، نظير بروسلا آگار با هِمين و ويتامين K و يك محيط انتخـابي واجد سوبستر هـايي كه رشد باسيل ‌هـاي گرم منفي روده ‌اي و   بي ‌هوازي‌ هاي اختياري يا كوكوس‌ هاي گرم مثبت بي‌ هوازي را باز دارد، كشت داده شوند. بسياري از محيط‌ هاي اختصاصي ديگر در باكتري ‌شناسيِ تشخيصي استفاده مي‌ شوند؛‌ انتخاب‌ ها به تشخيص باليني و ارگانيسم مورد بررسي بستگي دارند. كاركنان آزمايشگاه محيط‌ هاي اختصاصي را بر مبناي اطلاعات موجـود در درخواست كشت انتخاب مي‌ كنند. بنابراين، محيط‌ هـاي بوردِت - ژانگو يا محيط‌ حاوي چاركول (زغال چوب) براي تشخيص سياه سرفه، و ساير محيط‌ هاي اختصاصي براي كشت ويبريو كلرا، كورينه باكتريوم ديفتريا، نيسريا يا گونوره، و گونه ‌هاي كمپيلوباكتر استفاده مي‌شوند. براي كشت مايكوباكتريوم‌ ها، محيط‌ هاي اختصاصي جامد و مايع به طور معمول به كار برده مي ‌شوند. اين محيط‌ ها حاوي مهاركننده‌ هاي ساير باكتري ‌ها مي‌باشند. از آنجايي كه بسياري از مايكوباكتريوم‌ها به آهستگي رشد مي‌كنند، كشت ‌ها بايد هفته ‌ها انكوبه و به طور دوره‌ اي بررسي گردند (فصل 23 را ببينيد).

    كشت‌ هاي براث در محيط‌ هاي بسيار غني شده،‌ براي بك آپ كشت ‌ها از بافت‌ هاي بيوپسي و مايعات بدني نظير مايع مغزي نخاعي مهم هستند. زماني كه بر روي محيط‌ هاي جامد رشد وجود ندارد،‌ كشت ‌هاي براث ممكن است نتايج مثبت بدهند، زيرا تعداد اندكي از باكتري ‌ها در تلقيح حضور دارند (قبل را ببينيد).

    بسياري از مخمر ها بر روي بلاد آگار رشد خواهند نمود. قارچ‌ هاي دو مرحله ‌اي (بي ‌فازيك) و مرحله (فاز) میسليومي بر روي محيط ‌هايي كه به طور خاص براي قارچ‌ ها طراحي شده‌ اند، رشد بهتري دارند. بِرِيْن - هارت اينفيوژن آگار، با آنتي بيوتيك‌ ها و بدون آنها، و مولْد آگار مهاري عمدتاً جايگزين استفاده سنتي از سابورود دِكستروز آگار براي رشد قارچ ‌ها شده ‌اند. همچنين محيط ‌هاي ساخته شده از مواد گياهي (زيستگاه طبيعي تعداد زيادي از قارچ‌ ها) بسياري از قارچ ‌هاي مسبب عفونت‌ ها را رشد مي‌ دهند. كشت ‌ها براي قارچ‌ هـا معمولاً به صورت زوج انجام مي ‌پذيرند، كه يكي از آنها در دماي C°30-25 و ديگري در دماي C°37-35 انكوبه مي‌ گردد. در جدول 3-47 نمونه ‌ها و آزمون‌هاي مورد استفاده براي تشخيص عفونت‌هاي قارچي ذكر گرديده است.

    علاوه بر محيط‌ هاي استاندارد و انتخابي فوق، آگار هايي كه در آنها آنتي بيوتيك ‌ها الحاق شده ‌اند و حاوي سوبسترا هاي كروموژنيك (رنگ زا) اند، كه به ارگانيسم‌ هاي اختصاصي مورد نظر،‌ از قبيل استافيلوكوكوس اورئوس مقاوم به متيسيلين، انواع گونه ‌هـاي كانديدا، در ميان بسياري ديگـر، رنگ مي ‌بخشند، در دسـترس هستند. اين محيط ‌هـا در حالي كه گران ‌تر انـد،‌ به واسطه‌ مهار ميكروبيوتاي پس زمينه، بر حساسيت مي ‌افـزايند و اجازه شناسايي آسان ‌تر پاتوژن مورد نظر را مي ‌دهند. به طور معمول، اين آگار هاي كروموژنيك براي نمونه‌ هايي نظير كشت ‌هاي نظارت و كشت ‌هاي ادرار استفاده مي‌ شوند.

 

 

جدول 1-47 . روش‌ هاي رنگ ‌آميزي گرم و اسيد - فست

رنگ ‌‌آميزي گرم

1- اسمير را توسط حرارت، ثابت (فيكس) نماييد.

2- با كريستال ويوله بپوشانيد.

3- با آب بشوييد.

4- با يُد بپوشانيد.

5- با آب بشوييد.

6- با حركت ملايم در اَسِتون (mL 30) و الكل (mL 70) به مدت 30-10 ثانيه،‌ بي ‌رنگ نماييد.

7- با آب بشوييد.

8- با سافرانين (محلول 5/2% در الكل 95%) به مدت 30-10 ثانيه بپوشانيد.

9- با آب بشوييد و اجازه دهيد خشك شود.

رنگ ‌آميزي اسيد - فست زيل - نلسون

1- اسمير را با حرارت ثابت نماييد.

2- با كربول فوشين بپوشانيد، به آرامي به مدت 5 دقيقه روي شعله مستقيم (يا به مدت 20 دقيقه در آب گرم) بخار دهيد. اجازه ندهيد لام‌ ها بجوشند يا خشك شوند.

3- با آب مقطر بشوييد.

4- در اسيد - الكل 3% (اتانل 95% و اسيد هيدروكلريك 3%) بي ‌رنگ نماييد تا رنگ صورتي كم رنگ باقي بماند.

5- با آب بشوييد.

6- به مدت 1 دقيقه با متيلن بلو لوفلِر به طور متضاد رنگ ‌آميزي نماييد.

7- با آب مقطر بشوييد و اجازه دهيد خشك شود.

رنگ ‌آميزي اسيد - فست كربول فوشين كينيون

1- فرمول : g4 فوشين بازي، g 8 فنل، mL 20 الكل 95% ، mL 100 آب مقطر.

2- اسمير ثابت را به مدت 3 دقيقه رنگ ‌آميزي نماييد (حرارت نياز نيست) و به سان رنگ ‌آميزي زيل نلسون ادامه دهيد.

 

جدول 2-47. عفونت‌ هاي باكتريايي موضعي شايع و نوكارديوزيس

بيماري

نمونه

عوامل مسبب شايع

يافته ‌هاي ميكروسكوپي معمول

محيط‌ هاي كشت

توضيحات

 

سلوليت پوست

 

پانچ بيوپسي

استرپتوكوكوس‌ هاي β- هموليتيك گروه A استافيلوكوكوس اورئوس

 

گاه كوكوس ‌هاي گرم مثبت

 

بلاد آگار

بيوپسي در لبه قرمزي (اريتم) ممكن است ارگانيسم را ثمر دهد.

زرد زخم

سوآب

به سان سلوليت

(در بالا)

به سان سلوليت (در بالا) و فارنژيت (در پايين)

 

كشت به ندرت نشان دهنده است.

 

زخم ‌هاي پوست

پانچ بيوپسي، عميق ؛ بيرون كشيدن يا

بيوپسي بافت

 

فلور مخلوط

 

فلور مخلوط

بلاد، مك كانكي، ‌يا EMB آگار؛

محيط ‌هاي بي ‌هوازي

زخم ‌هاي پوست زير كمر اغلب حاوي هوازي ‌ها و

بي ‌هوازي ‌ها به سان فلور دستگاه گوارش است.

 

 

مننژيت

 

 

مايع مغزي نخاعي

 

 

نيسريا مننژايتيديس

 

ديپلوكوكوس‌ هاي درون سلولي گرم منفي

 

شكلات آگارa و بلاد آگار براي كشت  ‌هاي            مايع مغزي نخاعي

آگلوتيناسيون لاتكس (شناسايي آنتي ژن باكتريايي) يك آزمون ضعيف براي تشخيص عامل مننژيت است.

 

 

هموفيلوس آنفولانزا

 

كوكو باسيل‌ هاي         گرم منفي كوچك

 

 

شكلات آگارa

آگلوتيناسيون لاتكس (شناسايي آنتي ژن باكتريايي) يك آزمون ضعيف براي تشخيص عامل مننژيت است.

 

 

 

استرپتوكوكوس پنومونيه

 

 

كوكوس‌هاي گرم مثبت در قالب جفت

 

 

 

بلاد آگار

آگلوتيناسيون لاتكس (شناسايي آنتي ژن باكتريايي) يك آزمون ضعيف براي تشخيص عامل مننژيت است؛ سنجش ايمونو كروماتوگرافيك حساس ‌تر است.

 

استرپتوكوكوس ‌هاي گروه B

 

كوكوس ‌هاي گرم مثبت در قالب جفت و زنجيره

 

 

بلاد آگار

آگلوتيناسيون لاتكس (شناسايي آنتي ژن باكتريايي) يك آزمون ضعيف براي تشخيص عامل مننژيت است.

 

اشريشياكولي و            ساير انتروباكترياسه

 

باسيل‌ هاي گرم منفي

 

بلاد آگار

عمدتاً در نوزادان؛ در كشت مايع مغزي نخاعي به محيط‌هاي انتخابي نياز نيست.

 

ليستريا مونوسايتوژنز

 

باسيل‌ هاي گرم مثبت

 

بلادآگار

β- هموليتيك؛ ممكن است با استرپتوكوكوس‌ هاي گروه B اشتباه گرفته شود.

 

 

آبسه مغز

 

 

چرك

عفونت مخلوط، کوكوسها و باسيل‌هاي گرم مثبت و گرم منفي بيهوازي، كوكوس‌ هاي گرم مثبت هوازي

 

كوكوس ‌هاي گرم مثبت يا فلور مخلوط

 

بلادآگار، شكلات آگارa، محيط‌ هاي             بي ‌هوازي

 

نمونه بايد از طريق جراحي به دست آيد و تحت شرايط اكيداً بي‌ هوازي منتقل گردد.

 

آبسه پيرامون دهان

 

چرك

 

فلور مخلوط دهان يا حلق

 

فلور مخلوط

بلاد آگار، شكلات آگارa، مك كانكي يا EMB آگار؛            محيط‌ هاي بي هوازي

معمولاً عفونت باكتريايي مخلوط؛ به ندرت، اكتينومايكوزيس

 

فارنژيت

 

سوآب

استرپتوكوكوس ‌هاي گروه A

پیشنهاد نشده است.

بلاد آگار يا           محيط انتخابي

β - هموليتيك

 

كورينه باكتريوم ديفتريا

 

پیشنهاد نشده است.

محيط لوفلر يا پای، سپس محيط سيتوزين - تلوريت يا تينسدال

باسيل ‌هاي گرانولار در الگوي "حرف چيني" در اسميرهاي برگرفته از كشت؛ آزمون سميت لازم است.

 

سياه سرفه

(پرتوسيس)

 

 

سوآب

 

 

بوردتلا پرتوسيس

 

 

پیشنهاد نشده است.

 

 

رِگان - لُ آگار

آزمون فلئورسنت آنتي بادي ارگانيسم‌ ها را از كشت و گاه در اسمير هاي مستقيم شناسايي مي‌ كند؛ PCR حساس ‌تر از كشت است.

 

اپيگلوتيت

 

سوآب

 

هموفيلوس آنفولانزا

 

معمولاً سودمند نيست.

شكلات آگارa (همچنين بلاد آگار استفاده مي ‌شود)

هموفيلوس آنفولانزا بخشي از ميكروبيوتاي نرمال در نازوفارنكس است.

 

 

 

 

 

 

 

پنوموني

 

 

 

 

 

 

خلط يا ديگر

نمونه‌ هاي تنفسي

 

 

استرپتوكوكوس پنومونيه

تعداد زيادي پلي مورفو نوكلئر، كوكوس ‌هاي گرم مثبت در قالب جفت يا زنجيره. كپسول متورم شده با سرم جامع (آزمون كوئلانگ)

 

 

بلاد آگار؛ همچنين مك كانكي، EMB، و شكلات آگار

استرپتوكوكوس پنومونيه بخشي از ميكروبيوتاي نرمال در نازوفارنكس است. كشت ‌هاي بلاد آگار در 20-10 درصد از موارد، اختصاصي (مثبت) هستند.

استافيلوكوكوس اورئوس

كوكوس ‌هاي گرم مثبت در قالب جفت، چهار تايي و خوشه ‌اي

بلادآگار؛ همچنين مك كانكي، EMB، و شكلات آگار

عامل نامعمول پنوموني. معمولاً β- هموليتيك، كوآگولاز مثبت

انتروباكترياسه و ساير باسيل‌ هاي گرم منفي

باسيل‌ هاي گرم منفي

بلاد آگار، مك كانكي يا EMB آگار

عوامل پنوموني مرتبط با بيمارستان

 

 

بي‌هوازي ‌ها و           هوازي ‌هاي مخلوط

 

فلور مخلوط دستگاه تنفسي، گاه تعداد زيادي پلي مورفونوكلئر

 

بلاد، مك كانكي، يا EMB آگار؛

آگار بي ‌هوازي

نمونه‌ ها بايد به واسطه برونكوسكوپي با استفاده از بُرس حفاظت شده يا با مكش از ناي به دست

 آيند؛ خلط خارج شده از سینه برای بی هوازی ها رضایت بخش نیست.

آمپيم قفسه سينه (تجمع چرك در فضاي پرده جنب)

 

چرك

به سان پنومونی، یا عفونت فلور مخلوط

 

فلور مخلوط

بلاد، مك كانكي، يا EMB آگار،

محیط های بی هوازی

معمولاً پنومونی؛ فلور مخلوط هوازی و بی هوازی ناشی از اوروفارنکس

 

آبسه کبد

 

چرك

اشرشياكولي، باكتروئيدس فراژيليس،‌ فلور مخلوط هوازي و بي ‌هوازي

 

باسيل ‌هاي گرم منفي و فلور مخلوط

 

بلاد، مك كانكي، يا EMB آگار

معمولاً هوازي ‌ها و          بي ‌هوازي ‌هاي گرم منفي روده ‌اي، در نظر گرفتن عفونت انتامبا هيستوليتيكا

 

كولِسيستيت (التهاب كيسه صفرا)

 

صفرا

بي‌هوازي ‌هاي گرم منفي روده ‌اي، همچنين باكتروئيدس فراژيليس

 

باسيل‌ هاي گرم منفي

بلاد، مك كانكي يا EMB آگار؛

شرايط بي ‌هوازي

 

معمولاً باسيل‌هاي گرم منفي از دستگاه گوارش

آبسه شكم يا پيرامون ركتوم

 

چرك

 

فلور گوارشي

 

فلور مخلوط

بلاد، مك كانكي يا EMB آگار،

محيط‌ هاي بي ‌هوازي

فلور هوازي و بي ‌هوازي روده؛ اغلب بيش از پنج گونه رشد مي‌ كند.

 

تب روده‌ اي، تيفوئيد

 

خون، مدفوع، ادرار

 

سالمونلا تايفي

 

پیشنهاد نشده است.

مك كانكي، هِكتون، بيسموت سولفات، آگار، سايرين

انواع نمونه‌ ها بايد كشت شوند؛ لاكتوز منفي.

توليد H2S

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

انتريت، انتركوليت، اسهال‌ هاي باكتريايي، (گاستروانتريت‌)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مدفوع

 

گونه‌ هاي سالمونلا به غير از سالمونلا تايفي

 

رنگ آميزي گرم يا رنگ‌اميزي متيلن بلو ممكن است پلومورفو نوكلئرها را نشان دهد.

 

مك كانكي، هكتون، بيسموت سولفات آگار، سايرين

كلني‌هاي غير تخمير كننده لاكتوز در اسلنت‌هاي aTSI:  سالمونلا هاي غير تيفوئيدي اسيد و گاز را در پايه اسلنت، اسلنت قليايي و H2S ايجاد مي ‌كنند.

 

 

گونه ‌هاي شيگلا

رنگ ‌آميزي گرم يا رنگ ‌آميزي متيلن بلو ممكن است پلی مورفو نوكلئر ها را نشان دهد.

 

مك كانكي، ‌هكتون، بيسموت سولفات آگار، سايرين

كلني‌ هاي غير تخميركننده لاكتور در اسلنت ‌هاي TSI : شيگلا ها اسلنت قليايي، و در پايه اسلنت

اسيد بدون گاز را ايجاد

مي ‌كنند.

 

كمپيلوباكتر ژژوني

باسيل ‌هاي گرم منفي "بال مرغ مانند" و اغلب

پلي مورمونوكلئر ها

محيط Campy BAP يا محيط مشابه

انكوباسيون در دماي C°42؛ كلني‌ هاي اكسيداز مثبت؛ اسمير باسيل ‌هاي

"بال مرغ مانند" را نشان

مي ‌دهد.

 

 

ويبريو كلرا

 

 

پیشنهاد نشده است.

تايوسولفات سيترات بايل سالتْز (TCBS) سوكروز آگار؛ سايرين تائوروكولات - پپتون براث براي غني‌ سازي

 

كلني ‌هاي زرد بر روي TCBS. ويبريو كلرا اكسيداز مثبت است.

 

ساير ويبريوها

 

پیشنهاد نشده است.

 

به سان ويبريو كلرا

با آزمون‌ هاي بيوشيميايي و كشت از ويبريوكلرا متمايز مي‌ گردد.

 

يرسينيا انتروكوليتيكا

 

پیشنهاد نشده است.

 

مك كانكي، CIN

غني سازي در C°4 كمك كننده است؛ كشت‌ ها در

 C° 25 انكوبه شوند.

 

 

كوليت هموراژيك و سندرم هموليتيك اورميك

 

 

مدفوع

 

اشريشياكولي O157:H7 و

ساير سروتايپ‌ها

 

 

 

 پیشنهاد نشده است.

 

 

محيط سوربيتال مك كانكي

به كلني‌هاي سوربيتال منفي توجه شود؛ تايپ با آنتي سرم‌ها براي آنتي‌ژن O ي 157 و آنتي ژن فلاژلي 7؛ EIA یا PCR براي

توكسين ‌هاي شبه شيگا آزمون ‌هاي ارجح هستند.

 

 

عفونت دستگاه ادراري

ادرار (نمونه ادرار از جريان وسط گرفته شود يا توسط سوند مثانه يا مكش سوپرا پوبيك [از بالاي استخوان پوبيك يا شرمگاهي]

 

 

اشريشياكولي؛ انتروباكترياسه؛ ساير باسيل ‌هاي گرم منفي

باسيل‌ هاي گرم منفي ديده شده در اسمير رنگ ‌آميزي شده‌ ي ادرار سانتريفيوژ نشده بيش از 105 ارگانيسم را در هر mL نشان مي ‌دهند.

 

 

بلادآگار، مك كانكي يا EMB آگار

كلني‌هاي خاكستري كه β- هموليتيك ‌اند و در آزمون نقطه‌اي اندول نتيجه مثبت مي‌دهند معمولاً اشريشياكولي مي ‌باشند؛ سايرين نيازمند آزمون‌ هاي بيوشيميايي بيشتر هستند.

 

 

 

 

 

 

اورِتريت (التهاب پيشابراه) / سِرويسيت (التهاب گردن رحم)

 

 

 

 

 

 

سوآب

 

 

 

نيسريا گونوره

ديپلوكوكوس ‌هاي گرم منفي در پلي مورفونوكلئرها يا روي آنها. اختصاصي براي ترشح پيشابراهي در مردان؛ كمتر قابل اعتماد در زنان

 

 

تاير - مارتين اصلاح شده يا محيط انتخابي مشابه حاوي آنتي بيوتيك

اسمير رنگ ‌آميزي شده مثبت در مردان ارزش تشخيصي دارد. در زنان كشت يا آزمون ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك نياز است. گونوكوكوس ‌ها اكسيداز مثبت ‌اند.

 

 

 

 

 

كلاميديا تراكوماتيس

 

 

 

پلی مورفونوکلئر ها بدون

ديپلوكوكوس ‌هاي

گرم منفي همراه

 

 

 

كشت در مك كانكي آگار مواجه شده با سيكلوهگزاميد

انكلوژن‌ هاي هلالي شكل در سلول ‌هاي اپيتليال به واسطه رنگ ‌آميزي يا ايمونوفلئورسنس. آزمون‌هاي فلئورسنت آنتي بادي مستقيم مي ‌توانند سودمند باشند؛ آزمون ‌هاي تقويت اسيد نوكلئك حساس ‌تر اند و براي نمونه‌ هاي ادراري تناسي ارجح هستند.

 

 

 

زخم‌ هاي تناسلي

 

 

 

سوآب

هموفيلوس دوكريئي (شانكروئيد)

 

فلور مخلوط

شكلات آگار با ايزوويتال X و ونكومايسين

 

تشخيص افتراقي زخم ‌هاي تناسلي، عفونت هرپس سيمپلكس را شامل

مي ‌شود.

 

ترپنما پاليدوم

(سفليس)

بررسي زمينه تاريك يا فلئورسنت آنتي بادي اسپيروكت ‌ها را نشان مي ‌دهد.

 

ندارد

 

چرك كشيده شده از گره‌هاي لنفي چرك‌دار

كلاميديا تراكوماتيس (لنفوگرانولوم ونرئوم)

پلی مورفونوکلئر ها بدون ديپلوكوكوس‌ هاي گرم منفي همراه

كشت چرك در كشت سلولي (به سان اورتريت)

 

 

 

 

 

 

بيماري التهابي لگن

 

 

 

 

سوآب گردن رحم

 

 

 

نيسريا گونوره

 

پلی مورفونوکلئر ها با ديپلوكوكوس‌هاي گرم منفي همراه؛ ممكن است فلور مخلوط حضور داشته باشند.

 

تاير- مارتين اصلاح شده يا محيط انتخابي مشابه حاوي آنتي بيوتيك؛ آزمون تقويت اسيد نوكلئيك ارجح است.

 

 

 

 

 

ارگانيسم ‌هاي مسبب ممكن است گونوكوكوس ‌ها، بي‌هوازي‌ها و سايرين باشند. بي‌هوازي‌ها همواره در داخل دهانه رحم حضور دارند؛ بنابراين، نمونه اين ناحيه براي كشت بي ‌هوازي مناسب نيست.

 

كلاميديا تراكوماتيس

قبل را ببينيد؛‌ آزمون تقويت اسيد نوكلئيك ارجح است.

كشت سلولي (به سان اورتريت)

 

 

مكش از رحم يا توسط لاپاروسكوپ

نيسريا گونوره

ديپلوكوكوس ‌هاي

گرم منفي در

پلی مورفونوکلئر ها يا روي آنها

 

محيط اصلاح شده تاير - مارتين

كلاميديا تراكوماتيس

قبل را ببينيد.

كشت سلولي (به سان اورتريت)

 

فلور مخلوط

 

فلور مخلوط

بلاد، مك كانكي، يا EMB آگار؛ محيط بي‌هوازي

معمولاً باكتري‌هاي بي‌هوازي و هوازي مخلوط

 

 

 

آرتريت

 

 

 

مكش از مفصل، خون

 

استافيلوكوكوس اورئوس

كوكوس‌هاي گرم مثبت در قالب جفت، چهارتايي، و خوشه‌اي

 

بلاد آگار؛

شكلات آگارa

 

هم در كودكان و هم در بالغين رخ مي ‌دهد؛

كوآگولار مثبت،

معمولاً β- هموليتيك

 

نيسريا گونوره

ديپلوكوكوس‌هاي گرم منفي در PMN ها يا روي آنها

محيط تاير - مارتين اصلاح شده

 

سايرين

مورفولوژي به ارگانيسم ‌ها بستگي دارد.

بلاد آگار، شكلات آگارa؛ محيط بي‌هوازي

شامل استرپتوكوكوس‌ ها،‌ باسيل‌هاي گرم منفي، و

بي ‌هوازي ‌ها

 

 

اوستئوميليت

 

چرك يا نمونه استخوان به دست آمده از طريق مكش يا جراحي

 

متعدد؛

اغلب استافيلوكوكوس اورئوس

 

مورفولوژي به ارگانيسم ‌ها بستگي دارد.

 

بلاد آگار، مك كانكي، EMB آگار؛

محيط بي‌هوازي

معمولاً ارگانيسم‌ هاي هوازي؛ استافيلوكوكوس اورئوس شايع ‌ترين است؛ باسيل ‌هاي گرم منفي

شايع‌ اند؛ بي‌ هوازي ‌ها كمتر شايع مي‌ باشند.

 

a. يك  مكمل شيميايي نظير ايزوويتال X (IsoVitaleX) بر رشد گونه ‌هاي هموفيلوس و نيسريا مي ‌افزايد.

CIN، محيط سِفسولودين - ايرگاسان - نوووبيوسين (cefsulodin-irgasan-novobiocin mediumEIA، آنزيم ايمونواَسي (enzyme immunoassayTSI، تريپِل شوگِر آيرون آگار (triple sugar iron agar).

جدول 3-47. عفونت های قارچی شایع و نوکاردیوزیس

 

نمونه

آزمون های سرولوژیک و

سایر آزمون ها

توضیحات

مایکوز های تهاجمی (عمقی)

آسپرژیلوزیس : آسپرژیلوس فومیگاتوس، سایر گونه های آسپرژیلوس

 

ریوی

 

ترشحات تنفسی

سنجش های سرم / BAL گالاکتومانان در دسترس اند – حساسیت و اختصاصیت متغیر است.

 

سرولوژی به ندرت سودمند است.

منتشر

نمونه بیوپسی، خون

به سان قبلی

رشد آسپرژیلوس از خون بیماران مبتلا به عفونت منتشر دشوار است.

بلاستومایکوزیس : بلاستومایسس درماتایتیدیس

ریوی

ترشحات تنفسی

CF، EIA

آزمون CF معمولاً منفی است و از این رو چندان سودمند نیست. EIA حساس تر بوده، اما اختصاصیت کمتری دارد. کشت بهترین آزمون تشخیصی است؛ سرولوژی به ندرت انجام می شود. آنتی ژن ادرار با سایر قارچ ها واکنش متقاطع می دهد.

زخم های دهانی و جلدی

نمونه بیوپسی یا سوآب

CF، EIA، آنتی ژن ادرار

استخوان

بیوپسی استخوان

CF، EIA، آنتی ژن ادرار

کوکسیدیوئیدومایکوزیس : کوکسیدیوئیدس ایمیتیس

 

 

ریوی

 

 

ترشحات تنفسی

 

CF، ایمونودیفیوژن، پرسیپیتاسیون، آگلوتیناسیون لاتکس، EIA،

پروب DNA (تأیید کشت)

کوکسیدیوئیدس ایمیتیس بر روی کشت های روتین بلاد آگار رشد    می کند؛ کشت های مثبت یک خطر جدی برای کارکنان آزمایشگاه محسوب می شوند. کشت به واسطه پروب DNA به تأیید می رسد. سرولوژی اغلب سودمند تر از کشت است.

 

منتشر

نمونه بیوپسی از جایگاه عفونت، برای مثال پوست، استخوان

به سان قبلی، به استثنای این که آزمون پوستی با کوکسیدیوئیدین ممکن است منفی باشد.

هیستوپلاسموزیس : هیستوپلاسما کپسولاتوم

 

 

ریوی

 

 

ترشحات تنفسی

CF، ایمونودیفیوژن، آزمون های

آنتی بادی، آزمون آنتی ژن هیستوپلاسما روی سرم ادرار (حساس ترین) و مایع حاصل از شستشوی برونکوآلوئولار (نایژه ای حبابچه ای)

 

سرولوژی بسیار سودمند است، اما در مبتلایان به سرکوب ایمنی حساسیت کمتری دارد. کشت با پروب DNA به تأیید می رسد.

منتشر

مغز استخوان، خون، نمونه بیوپسی از جایگاه عفونت

به سان قبلی

نوکاردیوزیس : کمپلکس نوکاردیا آستروئیدس

ریوی

ترشحات تنفسی

رنگ آمیزی اسید- فست اصلاح شده

نوکاردیا ها باکتری هایی اند که

به لحاظ بالینی مانند قارچ ها رفتار    می کنند. باسیل های گرم مثبت، فیلامنتوس، منشعب،

و به طور ضعیف اسید - فست هستند.

تحت جلدی

مکش یا پیوپسی از آبسه

 

بر روی محیط های آزمایشگاهی استاندارد رشد می کنند.

 

مغز

 

مواد از آبسه

پارا کوکسیدیوئیدومایکوزیس (بلاستومایکوزیس آمریکای جنوبی) : پارا کوکسیدیوئیدس برازیلیئنسیس

 

 

 

نمونه بیوپسی از ضایعه

 

ایمونودیفیوژن، CF، آزمون پوستی (پاراکوکسیدیوئیدین) برای تشخیص قابل اعتماد نیست.

آزمون ایمونودیفیوژن 95% حساس و اختصاصی است؛ آزمون CF و آزمون پوستی با هیستوپلاسمین واکنش متقاطع می دهند. آزمون پوستی مثبت ارزش پیش آگهی دارد.

اسپوروتریکوزیس : اسپوروتریکس شنکیئی

ندول های پوستی و تحت جلدی

نمونه بیوپسی

آگلوتیناسیون

کشت سودمند تر از سرولوژی است.

منتشر

نمونه بیوپسی از جایگاه آلوده

به سان قبلی

 

زایگومایکوزیس : گونه های رایزوپوس، گونه های موکور، سایرین

رینوسِربِرال(عفونت بینی، چشم،مغز)

بافت مجرای بینی - اوربیتال

ندارد

هیف های فاقد تیغک در برش های میکروسکوپی دیده می شوند.

جلدی؛ ریوی و منتشر

ترشحات تنفسی، نمونه های بیوپسی

ندارد

کشت سودمند است.

عفونت های مخمر

کاندیدیازیس : کاندیدا آلبیکنس و مخمر های مشابهa

غشای مخاطی

ترشحات

در عفونت موضعی، KOH با لام مرطوب کالکوفلئور وایت برای بررسی با میکروسکوپ سودمند است.

معمولاً کشت از مواد بالینی آسان است.

پوست

نمونه سوآب

منتشره

خون، نمونه بیوپسی، ادرار

ایمونودیفیوژن

به سان قبلی، سرولوژی به ندرت سودمند است.

کریپتوکوکوزیس : کریپتوکوکوس نئوفورمانس

 

ریوی

 

ترشحات تنفسی

آنتی ژن کریپتوکوکی به ندرت شناسایی می شود.

آنتی بادی های ضد کریپتوکوکوس نئوفورمانس به ندرت یافت

می گردند.

مننژیت

CSF

شناسایی آنتی ژن کریپتوکوکی (سرم، CSF) بیش از همه سودمند است.

برای تشخیص مننژیت ممکن است بررسی مکرر CSF ضروری باشد.

منتشر

مغز استخوان، استخوان، خون ، سایر

آنتی ژن کریپتوکوکی در سرم

عفونت های پوستی اولیه

درماتوفیتوزیس : گونه های میکروسپوروم، گونه های اپیدرموفایتون، گونه های ترایکوفایتون

 

مو، پوست، ناخن از جایگاه های آلوده

ندارد

می تواند بر روی درماتوفیت آگار کشت شود.

 

a. کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا پارا پسیلوزیس، کاندیدا گلابرتا، و سایر گونه های کاندیدا.

CF، تثبیت کمپلمان (complement fixationCSF، مایع مغزی نخاعی (cerebrospinal fluidEIA، سنجش ایمنی آنزیم یا آنزیم ایمونواسی (enzyme immunoassay).

 

 

شناسايي آنتي ژن

 

سيستم ‌هـاي ايمونولوژيكِ طراحي شده بـراي شناسايي آنتي ‌‌‌ژن ‌هـاي ميكروارگانيسم‌ ها را مي ‌توان در تشخيص عفونت‌ هـاي خاص به كار برد. آزمون ‌هـاي IF (آزمون ‌هـاي فلئورسنت آنتي بادي مستقيم و غيـر مستقيم) يك فرم از شناسايي آنتي ‌ژن هستند و در بخش ‌هاي جداگانه در اين فصل، در قسمت تشخيص عفونت‌ هاي باكتريايي، كلاميديايي، ويروسي، و در فصول ، در قسمت ميكروارگانيسم‌ هاي اختصاصي بحث شده‌ اند.

    EIA ها، از جمله سنجش‌هاي جاذب ايمني مرتبط با آنزيم (ELISA) و آزمون‌ هـاي آگلوتيناسيون براي شناسايي آنتي ‌ژن‌ هاي عوامل عفونت ‌زاي حاضر در نمونه‌ هاي باليني استفاده مي‌ شوند. اصول اين آزمون ‌ها به طور خلاصه در اينجا بررسي مي ‌گردند.

    انواع متعددي از EIA براي شناسايي آنتي ‌ژن ‌هـا وجود دارد. يكي از          فرم‌ هاي رايج، اتصال يك آنتي ‌باديِ به دام افتاده (اختصاصي براي آنتي ژن مورد نظر) به چاهك ‌هاي سيني پلاستيكي ميكرو رقت است نمونه ‌ي حاوي آنتي ژن در چاهك ‌ها، پس از شستن آنها انكوبه مي ‌شود. آنتي بادي دوم براي آنتي ژن، كه با آنزيم نشان دار شده است، براي شناسايي آنتي ژن مورد استفاده قرار مي‌ گيرد. افزودن سوبسترا براي آنزيم اجازه شناسايي آنتي ‌ژن متصل شده را به واسطه واكنش كالِريمِتريك (رنگ سنجي) مي ‌دهد. يك تغيير معني ‌دار EIA، توسعه فرم‌ هاي غشاي ايمونو كروماتوگرافيك براي شناسايي آنتي ژن است. در اين فرم، يك غشاي نيترو سلولزي براي جذب آنتي ‌ژن از يك نمونه استفاده مي ‌شود. يك واكنش رنگي با افزودن متوالي كونژوگه به دنبال سوبسترا، مستقيماً بر روي غشا نمايان مي شود. در بعضي از فرم‌ ها، آنتي ‌ژن با اتصال آنتي بادي عليه آنتي ژن، به دام مي‌ افتد. اين سنجش‌ ها از مزيت سريع بودن برخوردار اند و نيز اغلب در بر دارنده يك  كنترل مثبت در خود هستند. يك مثال از اين نوع سنجش، آزمون آنتي ژن ادراري Binax NOW براي استرپتوكوكوس پنومونيه است. در برخي از EIA ها، آنتي بادي اوليه ضرورت ندارد، زيرا آنتي ژن مستقيماً به پلاستيك چاهك ‌ها اتصال مي ‌يابد. EIA ها براي شناسايي آنتي ‌ژن‌ هاي ويروسي،‌ باكتريايي، كلاميديايي، تك ياخته‌ اي، و قارچي در انواعي از نمونه ‌ها نظير مدفوع، مايع مغزي نخاعي، ‌ادرار، و نمونه ‌هاي تنفسي استفاده مي ‌شوند. مثال ‌هايي از اين موارد در فصول، در قسمت عوامل اتیولوژيك اختصاصي بحث‌ شده ‌اند.

    در آزمون ‌هاي آگلوتيناسيون لاتكس، يك آنتي بادي اختصاصي به آنتي ژن (پلي كلونال يا مونوكلونال)، به ذرات لاتكس ثابت مي‌ شود. هنگامي كه نمونه باليني به سوسپانسيون ذرات لاتكس افزوده شود، آنتي ‌بادي‌ ها به آنتي ژن‌ هاي روي ميكروارگانيسم ‌هاي سازنده یک ساختار شبکه متصل شده، و آگلوتيناسيون ذرات رخ مي ‌دهد. كوآگلوتيناسيون به آگلوتيناسيون لاتكس شباهت دارد، با اين تفاوت كه استافيلوكوكوس ‌هاي سرشار از پروتئين A (سويه كوان I) به جاي ذرات لاتكس استفاده مي ‌شوند؛‌ در مقايسه با آگلوتيناسيون لاتكس، كوآگلوتيناسيون براي شناسايي آنتي ژن سودمندي كمتـري دارد، امـا هنگامي كه براي شناسايي باكتري‌ هـا در كشت ‌هـا، نظيـر استرپتوكوكوس پنومونيه، نيسريـا مننژايتيديس، نيسريـا گونوره، و استرپتوكوكوس هاي β- هموليتيك به كار برده شود، سودمند مي ‌باشد.

    آزمون‌ هاي آگلوتيناسيون لاتكس عمدتاً به منظور شناسايي آنتي ژن ‌هاي كربوهيدراتي ميكروارگانسيم‌ هاي كپسول دار راهبردي مي شوند. شناسايي آنتي ‌ژن اغلب در تشخيص فارنژيت استرپتوكوكي گروهA  مورد استفاده است. شناسايي آنتي ژن كريپتوكوكي در تشخيص مننژيت كريپتوكوكي در مبتلايان به ايدز يا مبتلايان به ساير بيماري‌ هاي سركوب كننده سيستم ايمني سودمند مي‌ باشد.

    حساسيت آزمون‌هاي آگلوتيناسيون لاتكس در تشخيص مننژيت باكتريايي ممكن است بهتر از رنگ ‌آميزي گرم نباشد كه تقريباً 100,000 باكتري در هر ميلي ليتـر است. از ايـن رو، آزمون آگلويتناسيون لاتكس براي آزمـايش نمونه‌ هاي مستقيم توصيه نمي ‌گردد.

 

ايمونواسي های وسترن بلات

اين سنجش ‌هاي معمولاً براي شناسايي آنتي ‌بادي ‌ها عليه آنتي ‌ژن‌ هاي اختصاصي يك ارگانيسم خاص انجام مي ‌شوند. اين شيوه بر پايه جدا سازي الكتروفورِتيك پروتئين‌ هاي اصلي ارگانيسمِ مورد نظر در ژل آگاروز دو بعدي است. ارگانيسم ‌هـا به طور مكانيكي يا شيميـايي پاره مي ‌شوند، و آنتي ژن محلول حاصل از ارگانيسم در ژل پلي آكريل آميد قرار داده مي‌ شود. جريان الكتريكي برقرار مي ‌گـردد، و پروتئين‌ هاي اصلي بر پايه انـدازه از هم جـدا مي‌ شوند (پروتئين ‌هاي كوچك‌تر سريع‌تر حركت مي‌كنند). باند هاي پروتئين به نوار هاي كاغذ نيترو سلولز انتقال مي ‌يابند. پس از انكوباسيون نوار ها با نمونه بيمار كه حـاوي آنتي بادي (معمولاً سرم) است، آنتي بادي‌ هـا به پروتئين ‌هاي روي نوار متصل و در روشي مشابه با روش ‌هاي پيشتر توصيف شده‌ ي EIA، به طور آنزيمي شناسايي مي ‌گردند. آزمون ‌هاي وسترن بلات به عنوان آزمـون‌ هاي اختصاصي براي آنتي بادي ‌هـا در عفونت HIV يا بيماري لايم مورد استفاده ‌اند.

 

تشخيص ملكولي

اصل پايه سنجش ‌هاي ملكولي اوليه، هيبريدیزاسيون يك پروب اسيد نوكلئيك مشخص با يك توالي اختصاصيِ اسيد نوكلئيك در نمونه مورد آزمايش و سپس شناسايي هيبريد زوج است،‌ براي مثال، پروب تك رشته ‌اي DNA (يا RNA) جهت پي بردن به RNA مكمل يا DNA دناچوره شده در يك نمونه آزمايش استفاده مي‌شود. به منظور تسهيل در شناسايي محصول هيبريدیزاسيون، معمولاً پروب اسيد نوكلئيك با آنزيم ‌ها، سوبسترا هاي آنتي ژنيك،‌ ملكول ‌هاي شيميلومينِسنس ، يا راديو ايزوتوپ‌ ها نشان دار مي ‌گردد. با دقت در انتخـاب پروب يا ساخت اليگـو نوكلئوتيد اختصاصي و انجـام هيبريديزاسيون تحت شرايط بسيار دقيق، شناسايي اسيد نوكلئيك در نمونه مـورد آزمايش مي ‌تواند بسيـار اختصاصي شود. در حال حاضـر، چنين سنجش ‌هـايي عمدتاً براي تأييد سريع پاتوژن پس از شناسايي رشد به كار مي ‌روند، براي مثال، شناسايي مايكوباكتريوم توبركلوزيس در كشت با استفاده از پروب DNA شركت Gen-Probe مثالي از يك آزمون هيبريديزاسيون است كه در آن پروب و هدف در محلول مي ‌باشند. اكثر آزمايشگاه ‌هاي ميكروبيولوژي باليني از فرم ‌هاي هيبريديزاسيون محلول استفاده می نمایند. هيبريديزاسيون در محل (in situ) مستلزم استفاده از پروب ‌هاي DNA نشان ‌دار يا پروب ‌هاي RNA نشان‌ دار براي شناسايي اسيد هاي نوكلئيك مكمل در بافت ‌هاي كار گذاشته شده در پارافيـن و ثابت شده با فرماليـن،‌ بافت‌ هاي منجمد يا نمونه ‌هاي سيتولوژيك قرار داده شده بر روي لام است. از نظر فني، اين فرآيند مي ‌تواند دشوار باشد و معمولاً در آزمايشگاه‌ هـاي بافت شناسي و نه در آزمايشگاه ‌هـاي ميكروبيولوژي باليني انجام مي‌ گيرد. اين تكنيك بر دانش زيست‌ شناسي بسياري از بيماري ‌هاي عفوني، به ويژه هپاتيت ‌هـا و ويروس‌ هـاي انكوژن افزوده است، و همچنـان در تشخيص بيماري‌ هـاي عفوني سودمنـد مي‌ باشد. يك تكنيك جديد كه تا حـدودي از اصلاح هيبريديزاسيون در محل حاصل شده است، استفاده از پروب ‌هاي اسيد نوكلئيك پپتيد را ممكن مي ‌سازد، پروب‌ هاي اسيد نوكلئيك پپتيد قطعاتي سنتز شده از DNA اند كه در آنها ستون قند – فسفات از DNA (به طور معمول با بار منفي) با يك پلي آميد از واحد هاي تكراري (بار خنثي) جايگزين شده است. هر باز نوكلئوتيدي مي ‌تواند به ستون خنثي فعلي اتصال يابد كه اجازه هيبريديزاسيون سريع‌ تر و اختصاصي ‌تر با اسيد هاي نوكلئيك مكمل را مي ‌دهد. از آنجـايي كه پروب ‌هـا مصنوعي ‌انـد، آنها در معرض تجـزيه توسط نوكلئاز هـا و ساير آنزيم‌ هـا قرار نمي ‌گيرنـد. يك شركت تجـاري (AdvanDx، Woburn،MA) از تعدادي سنجش توضيح داده شده توسط FDA براي تأييد استافيلوكوكوس اورئوس، انتروكوكوس‌ ها، برخي از گونه‌هاي كانديدا، و بعضي از باسيل‌هاي گرم منفي در بطري‌هاي كشت خون مثبت برخوردار است. هيبريديزاسيون پروب به واسطه فلئورسنس شناسايي مي‌ گردد و هيبريديزاسيون در محل اسيد نوكلئيك پپتيد - فلئورسنس يا PNA-FISH (peptide nucleic acid–fluorescence in situ hybridization) ناميده مي ‌شود.

 

الف) شناسايي باكتري ‌ها با استفاده از rRNA ی S16

rRNA ی S16 از هر گونه از باكتري ‌ها داراي بخش ‌هاي با ثبات (حفظ شده) توالي است. در هر ارگانيسم كپي ‌هاي متعددي حضور دارند. پروب ‌هاي نشان ‌دار اختصاصي براي rRNA ی S16 هر گونه اضافه گرديده، و مقدار نشان روي هيبريد دو رشته‌ اي سنجيده مي‌ شود. اين تكنيك به طور گسترده براي شناسايي بسیاری از ارگانيسم ‌ها مورد استفاده قرار مي ‌گيرد. مثال ‌ها عبارتند از : شايع ‌ترين و مهم‌ترين گونه‌ هاي مايكوباكتريوم،‌ كوكسيديوئيدس ايميتيس، هيستوپلاسما كپسولاتوم، و سايرين.

    بخش ‌هايي از ژن rRNA ی S16 در ميان بسياري از ميكروارگانيسم ‌ها حفظ شده مي ‌باشد. تقويت ژن rRNA ی S16 با استفاده از پرايمر ها براي اين نواحي حفظ شده، اجازه جدا سازي و تعيين توالي نواحي متغيير اين مولكول‌ها را مي‌ دهد. اين توالي‌هاي متغيير، ماركر (نشان‌گر) هاي اختصاصي به جنس يا اختصاصي به گونه هستند كه اجازه شناسايي ميكروارگانيسم‌ ها را مي ‌دهند. پاتوژن ‌هايي كه كشت آنها در آزمايشگاه دشوار يا نامممكن است، به كمك اين تكنيك  شناسايي شده ‌اند. يك مثال تِروفريما ويپِلِئي، عامل بيماري ويپِل، مي ‌باشد.

    سنجـش ‌هاي تشخيصی ملكولي كه از تقويت اسیـد نوکلئیک استفاده  می کنند، کاربـرد گسترده ای پیدا کرده انـد، و به سرعت در حـال تکامل می باشند. این سیستم های تقویت، همچنان كه در ادامه شرح داده شده است، در چند طبقه اصلي جاي مي‌ گيرند.

 

ب) سيستم ‌هاي تقويت هدف

در اين سنجش‌ها DNA يا RNA هدف چندين بار تقويت مي‌ شود. براي تقويت مقادير بسيار كمي از DNA ي حاضـر در نمونـه باليني، واكنش زنجيره‌ اي پليمراز (PCR) مورد استفاده قرار گرفته، امكان شناسايي مقاديري از DNA را كه در ابتدا جـزئي بود، فراهم مي ‌آورد. PCR بـراي تقويت     دو برابري DNA هدف با هر چرخه دما، از DNA پليمراز مقاوم به حرارت استفاده مي‌ كند. PCR مرسوم از سه واكنش متوالي – دناچوره شدن (denaturation)، آنيلينگ يا هيبريد شدن (annealing)،‌ و بسط پرايمر (primer extention) – به شرح زير بهره مي ‌برد. DNA ی استخراج شده از نمونه باليني همراه با پرايمر هاي اليگونوكلئوتيدي اختصاصي به توالي، نوكلئوتيد ها، DNA پليمراز مقاوم به حرارت، و بافر به ميـزان C°95-90 حرارت مي ‌بينند تا دو رشته از DNA هدف دناچوره (جدا) گردند. دما در واكنش،‌ بر اساس پرايمر ها، معمولاً به C°60-45 كاهش داده مي‌شود تا اجازه آنيلينگ پرايمر ها به DNA هدف داده شود. آنگاه، هر پرايمر توسط DNA پليمراز مقاوم به حرارت،‌ با افزودن نوكلئوتيد هاي مكمل با DNA هدف، بسط مي ‌يابد و تقويت دو برابري حاصل مي‌ شود. سپس اين چرخه 40-30 بار تكرار مي‌ گردد. تا تقويت قطعه DNA هدف به ميزان 106-105 برابر به دست آيد. قطعه تقويت شده اغلب مي ‌تواند در يك ژل الكتروفورز ديده شود يا با آناليز سادرن بلات با استفاده از پروب‌ هاي DNA نشان‌دار اختصاصي براي قطعه يا با انواعي از تكنيك ‌هاي تجاريِ اختصاصي مورد شناسايي قرار گيرد. اخيراً، پروتكل ‌هاي PCR رئال تايم (زمان واقعي) جايگزين اين روش‌ هاي تشخيص نهايي شده ‌اند (ادامه را ببينيد).

    PCR همچنين مي ‌تواند بر روي اهداف RNA انجام شود، كه PCR ترانسكريپتاز معكوس (reverse transcriptase PCR) ناميده مي‌شود. آنزيم ترانسكريپتاز (نسخه بردار) معكوس جهت رونويسي RNA به DNA مكمل براي تقويت به كار مي ‌رود.

    سنجش ‌هاي PCR براي شناسايي طيف گسترده‌ اي از پاتوژن ‌هاي باكتريايي و ويروسي نظير كلاميديا تراكوماتيس، نيسريا گونوره، مايكو باكتريوم توبركلوزيس، سايتومگالوويروس، انتروويروس‌ ها، و بسياري ديگـر به طور تجاري در دسترس هستند. يك سنجش نيز براي آزمون بار ويروسي HIV-1 در دسترس مي ‌باشد. سنجش‌ هاي متعدد ديگري از PCR توسعه يافته ی آزمايشگاهي وجود دارند كه توسط هر آزمايشگاه براي تشخيص عفونت ‌ها به اجـرا در مي ‌آيند. چنين سنجش ‌هـايي آزمون‌ هـايي انتخابي براي تشخيص بسياري از عفونت ‌هـا به شمار مي ‌روند، به ويژه هنگامي كـه تكنيك ‌هاي سنتي كشت و شناسايي آنتي‌ ژن به خوبي كار نمي‌ كنند. مثال‌ها عبارتند از : آزمايش مايع مغزي نخاعي براي هرپس سيمپلكس ويروس جهت تشخيص انسفاليت هرپس و آزمايش مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس جهت تشخيص عفونت بوردتلا پرتوسيس (سياه سرفه).

    براي آزمايشگاه‌ هايي كه سنجش‌ هاي PCR را انجام مي‌دهند، جلوگيري از آلودگي مواد يا نمونه ‌ها با DNA هدف از محيط مهم است. DNA ی محيط مي‌ تواند تمايز بين نتايج مثبت حقيقي و نتايج مثبت كاذب ناشي از آلودگي را مبهم سازد.

 

پ) سيستم ‌هاي تقويت پروب

واكنش زنجيره ‌اي ليگاز يا LCR (ligase chain reaction) يك سيستم تقويت است كه متفاوت از PCR مي ‌باشد. LCR از DNA پليمراز مقاوم به حرارت و DNA ليگاز مقاوم به حرارت استفاده مي ‌كند. LCR از چهار پروب اليگونوكلئوتيد كه هر يك 24-20 باز دارد، استفاده مي ‌نمايد. هر جفت از اليگونوكلئوتيد براي اتصال به DNA دناچوره هدف تنها به فاصله چند باز، طراحي گرديده است. اليگونوكلئوتيد ها با DNA هدفِ استخراج شده از نمونه و ديگر مواد مخلوط گشته و آنگاه حرارت مي ‌بينند تا DNA هدف دناچوره شود. سپس واكنش سرد مي ‌گردد تا اجازه اتصال پروب ‌هاي اليگونوكلئوتيد به DNA هدف داده شود. شكاف (gap) كوتاه ميان دو پروب توسط DNA پليمراز پُر و توسط DNA ليگاز مرتبط مي ‌شود و ملكول DNA دو رشته ‌اي به طول 50-40 جفت باز پديد مي ‌آيد. چرخه 40-30 بار تكرار مي‌ گردد و شمار زيادي ملكول DNA ساخته مي ‌شود. اين سيستم كه به طور تجـاري در دسترس قـرار دارد، شامل شناسايي خودكـار DNA ي تقويت شده است. اين سيستم مي ‌تواند براي شناسايي كلاميسسديا تراكوماتيس و نيسريا گونوره به كار رود. اين سيستم تنها در خارج از آمريكا در دسترس مي ‌باشد.

ب) تكنيك‌ هاي تقويت سيگنال

اين سنجش‌ ها سيگنال را با تقويت نشان (براي مثال، آنزيم‌ هاي فلئورسنس) كه به اسيد نوكلئيك هدف اتصال مي‌ يابد، ‌تقويت مي‌كنند. سيستم DNAي منشعب (bDNA) [branched DNA] از يك سري پروب‌ هاي اوليه و پروب‌ هاي ثانويه منشعب نشان دار شده با آنزيم برخوردار است. پروب‌ هاي چندين اليگونوكلئتيديِ اختصاصي براي RNA (يا DNA) هدف به يك سطح جامد نظير سيني ميكرو رقت ثابت مي ‌شوند. اين پروب ‌ها، پروب ‌هاي به دام افتاده هستند. نمونه آماده شده اضافه مي ‌شود، و ملكول ‌هاي RNA به پروب ‌هاي به دام افتاده در سيني ميكرو رقت متصل مي‌گردند. پروب‌ هاي تقويت كننده bDNA كه با آنزيم نشان دار شده ‌اند، اضافه و به پروب‌ هاي هدف اتصال مي‌ يابند. يك سوبستراي شِميلومينِسنس افزوده مي‌ شود،‌ و نور ساطع شده به منظور تعيين مقدار RNA ي هدف حاضر اندازه‌گيري مي‌ شود. نمونه‌هايي از كاربرد اين نوع از سنجش عبارتند از: اندازه‌گيري كمي HIV-1، ويروس هپاتيت C، و ويروس هپاتيت B.

 

ث) شيوه‌ هاي تقويت : غير مبتني بر PCR

سيستم ‌هـاي تقويت بـا واسطه رونويسي يـا TMA (transcription-mediated amplification ) و تقويـت مبتني بـر توليـد اسيـد نوكلئـيك‌ يـا NASBA (nucleic acid sequence-based amplification ) كميت ‌هاي بزرگي از RNA را در سنجش ‌هاي ايزوتِرمال (هم دما) تقويت مي ‌كنند، كه در آنها به طور هم مرتبه آنزيم ‌هاي ترانسكريپتاز معكوس، RNase H، و RNA پليمراز به كار مي ‌روند. به يك پليمراز اليگونوكلئوتيدي حاوي پروموتر RNA پليمراز اجازه داده مي ‌شود تا به RNA هدف اتصال يابد. ترانسكريپتـاز معكوس يك كپي cDNA ي تك رشتـه ‌اي را از RNA مي ‌سـازد. RNase H، RNA را از هيبريد RNA-cDNA تخريب مي‌ نمايد و يك پرايمر دوم به قطعه cDNA پيوند مي ‌خورد. فعاليت DNA پليمراز وابسته به DNA در ترانسكريپتاز معكوس، DNA را از پرايمـر دوم توسعه (بسط) داده، يك كپي از DNA دو رشتـه‌ اي با RNA پليمـراز دست نخورده را توليد مي ‌كند. سپـس، RNA پليمـراز كپي ‌هاي متعددي از RNA ی تك رشته ‌اي را توليد مي ‌نمايد. شناسايي كلاميديا تراكوماتيس،‌ نيسريا گونوره، و مايكو توبركلوزيس، و اندازه‌ گيري بار HIV-1 مثال‌ هايي از كاربرد اين نوع از سنجش ‌ها هستند.

    سنجش‌ هاي جا به‌ جايي رشته يا SDA (strand displacement assays) سنجش‌ هاي تقويت ايزوترمال‌اند كه اندوكلئاز تحديدي و DNA پليمراز را به كار مي ‌برنـد. اندونوكلئاز تحـديدي DNA را در جايگاه ‌هـاي اختصاصي، شكاف داده، به DNA پليمراز اجازه مي‌ دهد تا همانند سازي را در شكاف‌ هاي روي ملكول هدف و به طور همزمان در رشته شكاف‌دار را ذز حال جا به جایی آغاز كند. سپس رشته‌ هاي جا به جا شده‌ ي تكي به عنوان الگو هايي براي تقويت اضافي به خدمت گرفته مي‌ شوند.

    تقويت ايزوترمال با واسطه حلقه يا LAMP (loop-mediated isothermal amplification) نام خود را از اين واقعيت مي ‌گيرد كه محصول نهايي تقويت متشكل از ساختاري است كه حاوي حلقه (تكرار) هاي متعدد از توالي هدف مي‌ باشد. واكنش، ايزوترمال است و خود چرخه شدگي سنتز DNA ي جابجايي رشته با استفاده از DNA پليمراز Bst و چهار تا شش پرايمر را شامل مي ‌گردد. محصولات تقويت مي‌ توانند در رئال تايـم، به واسطه رسوب DNA يا افزودن پيروفسفات منيزيم به واكنش شناسايي گردند؛ پيروفسفات منيزيم كدورت ايجاد مي‌ كند كه مي ‌تواند با چشم يا با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر خوانده شود. اين شيوه بسيار حساس است و 10 كپي از هدف را در هر واكنش مورد شناسايي قرار مي ‌دهد. يك سنجش تجاري با استفاده از فناوري LAMP براي شناسايي كلستريديوم ديفيسيل در نمونه ‌هاي مدفوع در دسترس است.

 

ج) PCR رئال تايم

پيشرفت ‌هاي فناوري كه به "تقويت رئال تايم" منجر شده ‌اند، برنامه ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك را ساده كرده ‌اند، حساسيت آزمون ‌هاي تقويت را بهبود بخشيده‌ اند، و پتانسيل براي آلودگي را به شدت كاهش داده‌ اند. ابزار هاي رئال تايم جايگزين بلوك جامد مورد استفاده در ترموسايكلِر هاي (چرخش دهنده‌ هاي حرارتي) سنتي شده‌ اند. ترموسايكلر هاي سنتي از پروانه‌ هايي برخوردار مي ‌باشند كه اجازه چرخش سريع ‌تر PCR را مي‌ دهند.

    پيشرفت ‌هاي قابل توجه در شيمي تقويت اسيد نوكلئيك به مخلوط ‌هاي همگن واكنش انجاميده است، كه در آنها تركيبات فلئوروژنيك در همان لوله واكنشي كه تقويت در آن رخ مي ‌دهد، حضور دارند. انواعي از ملكول ‌هاي فلئوروژنيك مورد استفاده قرار مي ‌گيرند [fluorogenic compound : تركيبي غير فلئورسنت كه در اثر عمل يك آنزيم به يك تركيب فلئورسنت تبديل مي ‌شود]. اين پيشرفت ‌ها عبارتند از : رنگ ‌هاي غير اختصاصي نظير سبز SYBR، كه به شيار كوچك DNA ی دو رشته‌ اي متصل مي ‌گردد، و روش‌ هـاي شناسايي اختصاصي آمپليكون (محصول PCR) با استفاده از پروب ‌هاي اليگونوكلئوتيدي نشان دار شده به طور فلئورسنت كه به سه دسته تقسيم مي ‌شوند : TaqMan يا پروب ‌هاي هيدروليز؛ پروب ‌هاي انتقال انرژي فلئورسنس يا FRET (fluorescence energy transfer)؛ و نشان‌ هاي ملكولي (molecular beacons). بحث كامل پيرامون اين روش‌ ها فراتر از محدوده اين فصل است. تمامي روش ‌ها اجازه اندازه‌ گيري فلئورسنس با هر چرخـه تقويت، يعني اندازه ‌گيري "رئـال تايـم" نتايـج را مي ‌دهند. از آنجايي كه نيازي به باز شدن لوله آزمايش براي آناليز محصولات PCR روي ژل نيست، خطر انتقال آمپليكون به واكنش بعدي به مراتب كمتر است.

 

طيف سنجي جرمی

طيف سنجي جرمی يا MS (mass spectrometry) – فناوري مورد استفاده جهت آناليز پروتئين ‌ها يا DNA – به عنوان يك رويكرد براي شناسايي ميكروبي در آزمايشگاه ‌هاي باليني درآمده است. MS شيوه ‌هايي نظير تابش يونيزاسيون را به منظور در هم گسيختن مواد سازنده ‌ي ذرات باردار به كار مي ‌برد كه به روش‌ هاي مختلف بر مبناي جرم يا نسبت جرم به بار شناسايي مي‌ شوند. برنامه‌ ها در ميكروبيولوژي با پيشرفت ‌ها در فناوري نظير طيف سنجي جرمي يونيزاسيون / دفع ليزري به كمك ماتريكس با زمان پرواز يا MALDI-TOF MS (matrix –assisted desorption ionization time-of flight mass spectroscopy) امكان پذير شده ‌اند. چند شيوه مختلف به طور خلاصه در ادامه شرح داده مي‌ شوند.

    PCR برچسب جرمي (MassTag PCR) يك برچسب (tag) با جرم مشخص (كتابخانه‌ اي از 64 برچسب جرمي به طور تجاري در دسترس است) را بـه درون محصول PCR الحـاق مي ‌كند. برچسب ‌هـايي كه اغلب در واكنش ‌هاي متعدد PCR استفاده مي ‌شوند، با تابش فرابنفش (UV) آزاد و با MS آناليز مي ‌گردند. ماهيت هدف يا اهداف مورد نظر با اندازه برچسب‌ (ها) تعيين مي ‌شود.

    طيف سنجي جرمي يونيزاسيون الكترواِسپري PCR يا PCR-ESI-MS (PCR electrospray ionization mass spectroscopy) از يك اصل منحصر به فرد استفاده مي‌ كند. به طور خلاصه، براي ميكروب‌هاي خاص، مجموع ه‌اي از پرايمر هاي PCR طراحي شده ‌اند كه نواحيِ كليدي از ژنوم ميكروبي را تقويت مي‌ كنند. واكنش‌ هاي متعدد PCR در يك پليت ميكرو تيتر براي آناليز هر نمونه انجام مي ‌پذيرند و برخي از چاهك‌ ها بيش از يك جفت پرايمر دارند. پس از PCR، پليت ميكرو تيتر بر روي يك ابزار كاملاً اتوماتيك قرار داده مي ‌شود و آناليز ESI-MS انجام مي‌ گيرد. طيف سنج جرمي يك ابزار تحليلي (آناليتيك) است كه به طور موثر آمپليكون ‌ها يا مخلوط آمپليكون‌ها، را با دقت جرمي كافي، وزن مي‌كند، به نحوي كه تركيب A، G، C، T مي ‌تواند براي هر آمپليكون در واكنش PCR استنباط شود. آنگاه تركيب تعيين شده با استفاده از پايگاه داده اختصاصي كه در جزء نرم افزار آیبيس پِلَت فُرم (Ibis platform) وجـود دارد، مـورد تحقيق قـرار مي‌ گيرد.

    دو پلت فرم بالا اجازه شناسايي مستقيم اسيد نوكلئيك ميكروب ‌ها را به طور مستقيم از نمونه ‌هاي باليني، بدون مرحله كشت، مي ‌دهند.، زيرا آنها از واكنش PCR استفاده مي ‌نمايند. برنامه ديگر، استفاده از MALDI-TOF براي شناسايي باكتري‌ ها و مخمر برداشت شده از كشت ‌هاي باليني است. دو پلت فرم تجاري، MALDI بيوتايپر (MALDI Biotyper) و شيمادزو (Shimadzu)، پروتئين ‌هاي ريبوزومي باكتري ‌ها و مخمر را هدف قرار مي ‌دهند. اصول پايه هر دو سيستم ايجاد يك اسمير نازك روي يك لام فلزي براي ارگانيسم شناسايي شونده و به كار بردن يك ماتريكس اسيدي براي آن را شامل مي ‌شوند. لام درون ابزار قرار داده مي ‌شود، جايي كه ضربان ليزر به مخلوط ارگانيسم اصابت مي ‌كنند. ملكول ‌هاي كوچكِ دفع شده و دِيونيزه از طريق يك ميدان الكترواستاتيك شتاب مي ‌گيرند و از ميان يك لوله خلاء رانده مي‌ شوند تا اين كه با آشكار ساز طيف سنج جرمي تماس مي ‌يابند. ملكول‌ هاي برخوردار از جرم و بار متفاوت در سرعت‌ هاي متفاوت "پرواز" (fly) مي ‌كنند (زمان پرواز [time of  flight]). يك اثر طيفي، عموماً در محدوده نسبت جرم به بار 20,000-1000 (m/z) توليد مي‌ شود. اين سيگنالِ طيفي با سايرين در پايگاه‌ هاي داده اختصاصي از هر ابزار براي جنس و گونه منتسب به ارگانيسم مقايسه مي‌ گردد.

 

اهميت ميكروبيوتاي  نرمال باكتريایی و قارچي

ارگانيسم‌ هايي نظير مايكوباكتريوم توبركلوزيس، سالمونلا تايفي، و گونه ‌هاي بروسلا هر زمان كه در نمونه‌ هاي بيمار يافت گردند، پاتوژن در نظر گرفته مي‌شوند. بسياري از عفونت‌ها توسط ارگانيسم‌هايي پديد مي‌آيند كه از اعضاي دائم يا گذراي ميكروبيوتاي نرمال هستند. براي مثال، اشريشياكولي بخشي از ميكروبيوتاي دستگاه گوارش است و همچنين شايع ‌ترين عامل عفونت ‌هاي دستگاه ادراري محسوب مي ‌شود. به طور مشابه، اكثريت قريب به اتفاق عفونت‌هاي باكترييايي مخلوط با بي‌هوازي‌ها از ارگانيسم‌هايي ناشي مي‌گردند كه اعضاي ميكروبيوتاي نرمال‌ اند.

    هنگامي كه اعضاي ميكروبيوتاي نرمال علت عفونت باشند، تعداد نسبي ارگانيسم ‌هاي اختصاصي حاضر در كشت اهميت دارد. زماني كه باسيل‌ هاي گرم منفي متعدد از گونه‌هايي نظير كلبسيلا پنومونيه مخلوط با تعداد اندكي از باكتري ‌هاي نرمال نازوفارنكس در كشت خلط يافت شوند،‌ باسيل‌ هاي گرم منفي به عنوان عامل پنوموني قويـاً مورد ظن قـرار مي ‌گيرند، زيـرا تعداد زيادي از باسيل‌ هاي گرم منفي به طور طبيعي در خلط يا در ميكروبيوتاي نازوفارنكس يافت نمي‌ گردند؛ اين ارگانيسم‌ ها بايد شناسايي و گزارش شوند. در مقابل، آبسه‌هاي شكمي معمولاً در بر دارنده توزيع نرمالي از ارگانيسم‌هاي هوازي، بي ‌هوازي اختياري، و بي هوازي اجباري (بيانگر ميكروبيوتاي دستگاه گوارش) هستند. در چنين مـواردي، شناسايي تمام گونه‌ هاي حاضر لازم نيست، به جاي آن مناسب است كه با عنوان "ميكروبيوتاي نرمال دستگاه گوارش" گزارش شود.

    معمولاً مخمر ها در تعداد اندك بخشي از ميكروبيوتاي نرمال مي ‌باشند. با اين حال، ساير قارچ‌ ها به طور طبيعي حضور ندارند، و از اين رو بايد شناسايي و گزارش گردند. ويروس‌ ها معمولاً بخشي از ميكروبيوتاي نرمال به شمار نمي ‌روند، و در آزمايشگاه ‌هاي ميكروبيولوژي تشخيصي مورد شناسايي قرار مي ‌گيرند. اگرچه، برخي از ويروس ‌هاي نهفته، مانند هرپس سيمپلكس، يا ويروس ‌هاي واكسن زنده نظير پوليوويروس، گاه در كشت براي ويروس ‌ها نمايان مي ‌شوند. در بخش هایی از جهان، نمونه های مدفوع معمولاً مدرکی از عفونت انگلی را ارائه می دهند. در چنين مواردي، تعداد نسبي انگل ‌هاي مرتبط با تظاهرات باليني است كه اهميت دارد.

    اعضايي از ميكروبيوتاي نرمال كه غالباً در نمونه‌ هاي بيمار حضور دارند و ممكن است به عنوان "ميكروبيوتاي نرمال" گزارش شوند،‌ در فصل 10 به بحث گذاشته شده‌ اند.

 

آزمايشگاه در انتخاب درمان ضد ميكروبي كمك مي ‌كند.

داروي ضد ميكروبي مورد استفاده در ابتداي درمان يك عفونت بر پايه تصور باليني، پس از آن كه پزشك متقاعد شد كه عفونت وجود دارد و او بر اساس زمينه ‌هاي باليني به تشخيص اتیولوژيك تجـربي رسيد، انتخـاب مي ‌شود. بر پايه اين "بهترين حدس"، داروي انتخابيِ احتمالی را مي ‌توان انتخاب نمود (فصل 28 را ببينيد). پيش از آن كه چنين دارويي تجويز شود، نمونه ‌ها براي جـدا سازي آزمايشگاهيِ عامل مسبب به دست مي ‌آيند. نتايـج اين آزمايشات ممكن است انتخاب يك داروي متفاوت را ناگزير سازند. شناسايي ميكروارگنيسم‌ هاي خاصي كه به طور يكنواخت به دارو حساس ‌اند، نياز به آزمايش ‌هاي بيشتر را مرتفع مي‌ كند و اجازه انتخاب دارو هايي كه به طور بهينه اثرگذار هستند را صرفاً بر پايه تجربه مي ‌دهد. در شرايط ديگر، آزمون‌ها بـراي حساسيت دارويي ميكروارگانيسم ‌هـاي جدا شده ممكن است سودمند باشند (فصل 28 را ببينيد).

    آزمون حساسيت انتشار ديسك (disc diffusion susceptibility test) كه معمولاً انجام مي ‌گيرد، بايد صحيح به كار برده شود و با محدوديت تفسير گردد. به طور كلي، تنها يك عضو از هر كلاس اصلي از دارو ها نماينده است. براي استافيلوكوكوس ‌ها، پني ‌سيلين G، اوكساسيلين، سفازولين، اريترومايسين، جنتامايسين، و ونكومايسين استفاده مي ‌شوند. براي باسيل ‌هاي گرم منفي، آمپي سيلين، سفازولين و سفالوسپورين ‌هاي نسل سوم، پيپراسيلين و ساير "پني‌ سيلين ‌هاي آنتي پسودومونايي"، كاربا پنم‌ها،‌ تري متوپريم سولفامتوكسازول، فلئوروكوئينولون ‌ها، و آمينوگليكوزيد ها (آميكاسين، توبرامايسين، جنتامايسين) اختصاص مي ‌يابند. براي عفونت ‌هاي دستگاه اداري ناشي از باسيل‌ هاي گرم منفي، نيتروفورانتوئين،‌ كوئينولون ‌ها، فسفومايسين، و تري متوپريم ممكن است اضافه شوند. انتخاب دارو هايي كه در يك سلسله آزمون ‌هاي حساسيت روتين برگزیده مي ‌شوند،‌ بايد بر پايه الگو هاي حساسيت جدا شده ها در آزمايشگاه، نوع عفونت (كسب شونده از جامعه يا بيمارستاني)، منبع عفونت، و تجزيه و تحليل مقرون به صرفه بودن براي جمعيت بيمار، صورت پذيرد. مؤسسه استانداردهاي باليني و آزمايشگاهي يا CLSI (clinical and laboratory standards Institute) براي عواملي كه بر پايه ارگانيسمِ برداشت شده و نوع نمونه آزمايش مي‌شوند،‌ توصيه‌ هايي را ارائه مي ‌دهد.

    اندازه هاله ‌هاي مهاري رشد بر اساس خصوصيات فارماکولوژيكيِ داروهاي مختلف فرق مي ‌كند. بنابراين، اندازه هاله يك دارو را نمي ‌توان با اندازه هاله داروي ديگري كه روي همان ارگانيسم عمل مي ‌كند، مقايسه نمود. با اين وجود، براي هر دارو اندازه هاله مي ‌تواند با استاندارد مقايسه گردد، منوط به اين كه محيط ‌هـا، اندازه تلقيح، و سايـر شرايط به دقت تنظيم شده باشند. در نتيجه، اين امكان فراهم مي ‌شود تا براي هر دارويي يك قطر حداقلي از هاله مهاري تعريف گردد كه "حساسيت" يك جدا شده را به واسطه تكنيك انتشار ديسك مشخص مي‌ كند.

    آزمـون ديسك توانايي دارو هـا براي مهار رشد باكتري‌ هـا را مي ‌سنجد. در آن دسته از بيماري‌ هـايي كه در آنها دفاع ‌هـاي بدن غالباً مي‌ توانند ميكروارگانيسم‌ هـاي عفونت ‌زا را بزدانيد، نتايج اين آزمون‌ هـا به خوبي با پاسخ‌ هاي درماني مرتبط ‌اند.

    در چند نوع از عفونت ‌هاي انساني، نتايج آزمون ‌هاي ديسك كمك اندكي مي كنند (و ممكن است گمراه كننده باشند)، زيرا براي درمان، اثر باكتري سيدالي دارو لازم است. نمونه ‌هاي برجسته عبارتند از : اندوكارديت عفوني، اوستئوميليت حاد، و عفونت ‌هاي شديد در ميزباني كه دفاع‌هاي ضد باكتريايي در او ناكافي مي ‌باشند، مانند مبتلايان به بيماري ‌هاي نئوپلاستيك که با تابش و شیمی درمانیِ آنتی نئوپلاستیک تحت درمان قرار گرفته ‌اند يا افرادي كه كورتيكواستروئيدها را در دوز بالا مصرف كرده‌اند، و كساني كه به سركوب ايمني دچار هستند.

    به جاي آزمون ديسك، آزمون نيمه كمّي حداقل غلظت‌ مهاري يا MIC (minimum inhibitory concentration) مي ‌تواند استفاده شود. اين آزمون غلظت آنتي بيوتيك لازم براي مهار رشد يك تلقيح استاندارد شده تحت شرايط تعريف شده را دقيق‌ تر مي‌ سنجد. يك روش ميكرو رقتِ نيمه خودكار مورد استفاده قرار مي‌ گيرد كه در آن مقادير تعريف شده‌ اي از دارو در حجم اندكِ سنجيده شده ‌اي از براث حل مي ‌شود و با تعداد استاندارد شده‌اي از ميكروارگانيسم‌ ها تلقيح مي‌ گردد. نقطه پايان يا MIC، آخرين فنجان براث (كمترين غلظت دارو) در نظر گرفته مي شود كه شفاف يعني فاقد رشد ميكروبي باقي مي ‌ماند. MIC برآورد بهتري از ميزان احتمالي داروي لازم براي مهـار رشد در بدن موجـود زنده را در اختيار مي ‌گذارد و بنابراين در اندازه‌ گيري مقدار داروي تجويز شونده ی لازم براي بيمار كمك مي ‌نمايد.

    همچنـان كه پيشتر ذكر گرديـد، آزمايشگاه‌ هـاي ميكروبيولوژي باليني آزمون‌ هـاي انتشار ديسك و آزمون‌ هـاي مبتني بر تعيين MIC را انجـام مي‌ دهند و نتايج خود را با استفاده از رهنمود هاي ارائه شده توسط CLSI تفسيـر مي كنند. به علاوه، براي كمك به راهنمای انتخاب ‌هـاي درمان تجربي، پيش از آن كه نتايج آزمون‌ هاي حساسيت ضد ميكروبي در دسترس قرار گيرند،‌ توسط CLSI توصيه مي ‌شود كه آزمايشگاه‌ ها يك آنتي بيوگرام را سالانه گزارش دهند كه حاوي نتايج آزمون حساسيت در مجموع براي ارگانيسم‌ - تركيب شدن ‌هاي دارويي بخصوص باشد. براي مثال، دانستن فعال ‌ترين عامل ضد ميكروبي β- لاكتام عليه پسودوموناس آئروژنيوزا در ميان بيماران بستري در بخش‌ مراقبت ‌هاي ويژه در يك بيمارستان خاص ممكن است اهميت داشته باشد، به نحوي كه اين عامل بتواند هنگامي كه بيمار در جریان بستري بودن در آن واحد يك عفونت را توسعه مي ‌دهد، مورد استفاده قرار گيرد.

    شيوه‌ هاي ديگري نيز به منظور ارزيابي کارآیی يك درمان ضد ميكروبي وجود دارد. اثرات باكتري سيدال را مي ‌توان با ساب كالچر براث شفاف به محيط‌ هاي جامد عاري از آنتي بيوتيك برآورد نمود. نتیجه،‌ به عنوان  مثال كـاهش واحد هـاي تشكيل دهنـده كلني تا 9/99% زيـر كنترل، حـداقل غلظت باكتري سيدالي يا MBC نامیده (minimum bactericidal concentration) مي ‌شود.

    به انتخاب يك دارو يا تركيبي از دارو هاي باكتري سيدال براي يك بيمار مي ‌توان با استفاده از آزمـون‌ هاي آزمايشگاهي ويـژه هدايت شد. چنين آزمون ‌هايی سرعت كشتار (سنجش زمان كشتار) جمعيت ميكروبي يا بخشي از جمعيت ميكـروبي كه در يك زمان ثابت كشته مي ‌شود (آزمـون باكتري سيدال سرم) را اندازه ‌گيري مي‌ كنند.

    در عفونت‌ هـاي دستگاه ادراري،‌ فعاليت ضد باكتريايي ادرار به مـراتب مهم‌ تـر از فعاليت ضد باكتريايي سرم است. همچنين، براي عفونت ‌هـاي سيستم عصبي مركزي، تنها عوامل ضد ميكروبي ‌اي كه از سد خون - مغز مي‌ گذرند، را بايد آزمود و گزارش كرد (فصل 28 را ببينيد).

 

تشخيص عفونت بر اساس جايگاه آناتوميك

زخم ‌ها،‌ بافت ‌ها، استخوان‌ ها، آبسه ‌ها، و مايعات

مطالعه ميكروسكوپي اسميـر ها و كشت نمونه ‌هاي برگرفته از زخـم ‌ها يا آبسه‌ها اغلب نشانه ‌هاي اوليه و مهمي از ماهيت ارگانيسم عفونت ‌زا را آشكار مي‌ سازد و بنابراين در انتخـاب دارو هـاي ضد ميكـروبي كمك مي‌ كند. نمونه‌ هاي حاصل از بيوپسي ‌هاي تشخيصي بافت بايد به منظور بررسي باكتريولوژيكي و همچنين هيستولوژيكي ارسال گردند. اين قبيل نمونه ‌ها براي بررسي باكتريولوژيكي، از ثابت كننده‌ ها و گند زدا ها دور نگه داشته شده، خرد مي ‌شوند، و كشت آنها توسط انواعي از شيوه ‌ها انجام مي ‌پذيرد.

    چرك در آبسه‌ هاي بسته و زهكشي نشده‌ ي بافت نرم غالباً تنها در بر دارنده يك ارگانيسم به عنوان عامل عفونت‌ زا است،‌ شايع ‌ترين ارگانيسم‌ ها در ايـن خصوص عبارتند از : استافيـلوكوكوس ‌هـا، استرپتـوكوكوس‌ هـا، يا باسيل ‌هاي گرم منفي انتریک. مشابه اين وضعيت در اوستئوميليت‌ حاد صدق مي‌ كند، كه در آن ارگانيسم ‌ها را مي‌ توان اغلب پيش از آن كه عفونت مزمن شود، از خون كشت داد. در آبسه ‌هاي شكمي و آبسه ‌هاي مجاور با سطوح مخاطي، به علاوه در زخم ‌هاي باز، غالباً ميكروارگانيسم‌ هاي متعددي حضور دارند. هنگامي كه ضايعات چرك ‌زاي عميق، نظير اوستئوميليت مزمن، از ميان يك سينوس يا فيستول به سطح خارجي كشيده شوند، فلور سطحي نبايد با ميكروارگانيسم‌ هاي حاضر در ضايعه عميق اشتباه گرفته شود. به جاي آن، نمونه‌ ها بايد از عفونت اصلي و از ميان بافت سالم مكش گردند.

    بررسي باكتريولوژيك چرك برگرفته از ضايعات بسته يا عمقي بايد شامل كشت با شيوه ‌هاي بي‌ هوازي باشد. باكتري ‌هاي بي ‌هوازي (باكتروئيدز، پپتو استرپتوكوكوس‌ ها) گاهي اوقات يك نقش مسببيِ حياتي را ايفا مي‌ كنند، و اغلب مخلوطي از بي ‌هوازي ‌ها حضور دارند.

    شيوه‌ هاي مورد استفاده براي كشت‌ ها بايد جهت برداشت نيمه كمّي باكتري‌ هاي شايع و همچنين براي برداشت ميكروارگانيسم ‌هاي خاص، نظير مايكوباكتريوم ‌ها و قارچ‌ ها مناسب باشند. غشا هاي مخاطي و پوست فرسوده غالباً جايگاه عفونت‌ هاي ناشي از مخمر و قارچ هستند. كانديدا، آسپرژيلوس، و ساير مخمر ها و قارچ ‌ها را مي‌ توان به طور ميكروسكوپي در اسمير ها يا مواد خراش داده شده از نواحي مشكوت رؤيت نمود، و آنها مي‌ توانند در كشت‌ ها رشد كنند. مواجهه يك نمونه با KOH و كالكوفلئور وايت تا حد زيادي مشاهده مخمر ها و كپك‌ هاي حاضر در نمونه را ارتقا مي ‌بخشد.

    ترشحاتي كه در فضاهاي جنب (پلور)، صفاق (پريتونئوم)، قلب (پريكارد)، يا مفصل (سينوويوم) تجمع مي ‌يابند، بايد با تكنيك ‌هاي آسپتيك آسپيره (مكش) شوند. چنانچه اين مواد آشكارا چركي باشند، اسمير ها و كشت ‌ها بايد مستقيماً ايجاد گردند. در صورتي كه اين مايعات شفاف باشند، مي ‌توان آنها را در سرعت ‌هاي بالا براي 10 دقيقه سانتريفيوژ نمود و از رسوب براي اسمير هاي رنگ ‌آميزي شونده و كشت‌ ها استفاده كرد. روش كشت مورد استفاده بايد با رشد ارگانيسم ‌هاي مشكوك در مواد باليني مناسب باشد. برخي از نمونه‌ هاي مايع لخته مي ‌شوند، و كشت يك نمونه آنتي گوآگوله (ضد لخته) ممكن است لازم باشد. نتايج شيمي و خون شناسي زير پيشنهاد بر عفونت مي‌ دهند : چگالي اختصاصي بيشتر از 018/1، محتواي پروتئين بيشتر از g/dL 3 (اغلب ماحصل لخته شدگي)، و شمار سلول بيشتر از 1000-500 در μL. در عفونت ‌هاي پايوژنيك (چرك ‌زا) درمان نشده‌ ي حاد، گلبول ‌هاي سفيـد پلي مورفو نوكلئر غالب هستند؛‌ لنفوسيت ‌هـا يا مونوسيت ‌هـا در عفونت‌ هاي مزمن غالبيت دارند. مواد مترشحه از رشد نئوپلاستيك ممكن است بسيار شبيه به ترشحات عفوني بوده با خون يا چرك و با لخته شدن ظاهر گردند. مطالعه سيتولوژيك (سلول‌شناسي) اسميرها يا مقاطع سلول ‌هاي سانتريفيوژ شده ممكن است ماهيت نئوپلاستيك (بدخيمي) فرآيند را ثابت نمايد.

 

خون

از آنجايي كه باكتريمي از بيماري تهديد كننده حيات خبر مي ‌دهد. شناسايي زودهنگام آن ضروري است. كشت خون تنها روش مهم جهت پي بردن به عفونت منتشره‌ي ناشي از باكتري‌ها مي‌باشد. اين روش براي مديريت بيماران تب ‌دار كه با علائم و نشانه‌ هاي موضعي يا بدون آنها، به طور حاد بيمار اند، اطلاعات ارزشمنـدي را در اختيـار مي ‌نهد، و براي هر بيمار مشكوك به اندوكارديت عفوني لازم است، حتي اگر به طور حاد يا به شدت بيمار به نظر نرسد. برداشت يك عامل عفوني از خون، علاوه بر اهميـت تشخيصي آن، كمك ارزشمنـدي به تعيين درمـان ضد ميكروبي مي ‌كنـد. از ايـن رو، هر كوششي بايد به منظور جدا سازي ارگانيسم‌ هاي مسبب در باكتريمي صورت پذيرد.

    در اشخاص سالم، نمونه ‌هاي خوني كه به درستي به دست آمده باشند، استريل هستند. اگرچه ميكروارگانيسم ‌هـا از ميكروبيوتاي دستگاه تنفسي و گوارشي سالم گاهي اوقات به خون راه مي ‌يابند، اما آنها توسط سيستم رتيكلو اندوتليال به سرعت حذف مي ‌شوند. اين ميكروارگانيسم ‌هاي گذرا ندرتاً بر تفسير نتايج خون تأثير مي‌گذارند. چنانچه يك كشت ميكروارگانيسم ‌ها را ثمر دهد، از اهميت باليني به سزايي برخوردار خواهد بود، منوط به اين كه از آلودگي جلوگيري شده باشد. آلودگي كشت‌ هاي خون با ميكروبيوتاي نرمال پوست به دليل، خطا هـا در فرآيند جمع ‌آوري، اغلب رخ مي‌ دهد. بنابرايـن، به كار بردن تكنيك صحيح در انجام كشت خون ضروري است.

    قوانين زير، چنانچه به شدت اعمال گردند، نتايج قابل اعتماد را به دست مي ‌دهند :

 

  1. از تكنيك دقيق آسپتيك استفاده كنيد. دستكش ‌ها را بپوشيد – ضرورتي ندارد آنها استريل باشند.
  2. يك شريان بند برداشته و با تماس، يك رگ ثابت را بيابيد. هنگامي كه پوست در حال آماده شدن است، شريان بند را رها نماييد.
  3. با پاكسازي شديد پوست توسط الكل ايزوپروپيل 95-70 درصد، آن را براي رگ‌ گيري آماده سازيد. با استفاده از تنتوريد 2% يا كلرهگزيدين 2% پوست را در جايگاه رگ ‌گيري به صورت دايره‌ هاي هم مركز و با افزايش قطر تمييز نماييد. براي دست كم 30 ثانيه اجازه دهيد تا ماده ضد عفوني كننده خشك شود. پس از آن پوست را لمس نكنيد.
  4. مجدداً از شريان بند استفاده كرده،‌ رگ‌گيري را انجام دهيد، و (براي بالغين) حدود mL 20 از خون را بكشيد.
  5. خون را به بطري ‌هاي برچسب دارِ كشت هوازي و بي ‌هوازيِ خون اضافه نماييد.
  6. نمونه ‌ها را بي‌ درنگ به آزمايشگاه برده، يا آنها را در انكوباتور C°37 بگذاريد.

 

    چند عامل در تعيين نتيجه ی مثبت كشت ‌هاي خون اثر گذار هستند : حجم خون كشت شده، رقت خون در محيط كشت، استفاده از هر دو محيط كشت هوازي و بي ‌هوازي، و مدت انكوباسيون. براي بالغين، معمولاً براي هر كشت، mL 30-20 خون برداشت می شود، و نيمي از آن در يك بطري كشت هوازي خون و نيم ديگر در يك بطري بي ‌هوازي قرار می گیرد. اگرچه، براي بسياري از سيستم‌ هاي كشت حاضر ممكن است حجم‌ هاي متفاوتي از خون لازم باشند. يك سيستم كشت خون كه به طور گسترده به كار برده مي ‌شود، از بطري ‌هايي استفاده مي‌ كند كه به جاي mL 10 خون، mL 5 خون را نگه مي‌ دارند. رقت بهينه‌ ي خون در يك محيط كشت مايع 150 : 1 – 300 : 1 است؛ اين رقت اثر سيستم‌هاي ضد باكتريايي آنتي بادي، كمپلمان، و گلبول سفيد را كه در خـون حضور دارند، به حداقل مي ‌رساند. از آنجايي كه چنين رقت ‌هايي در كشت ‌هاي خون غير عملي هستند، اكثر محيط‌ ها حاوي 05/0 درصد سديم پلي آنِتول سولفونات (SPS) بوده، كه سيستم‌ هاي ضد باكتريايي را مهار مي‌ سازد. هرچند SPS همچنين رشد برخي از نيسريا ها و كوكوس‌هاي گرم مثبت بي ‌هوازي و گاردنرلا واژيناليس را باز مي ‌دارد. چنانچه هر يك از اين ارگانيسم‌ ها مورد ظن باشند، بايد از سيستم‌ هاي كشت خون ديگري بدون SPS استفاده كرد.

    كشت‌ هاي خون براي 7-5 روز انكوبه مي ‌شوند. سيستم ‌هاي خودكار (اتوماتيك) كشت خون از انواعي از شيوه ‌ها جهت شناسايي كشت‌ هاي مثبت بهره مي ‌برند. اين شيوه‌ هاي اتوماتيك اجازه نظارت مكرر بر كشت ‌ها – اغلب هر چند دقيقه – و شناسايي زودتر موارد مثبت را مي‌ دهند. محيط‌ ها در سيستم‌ هاي اتوماتيك كشت خون بسيار غني شده‌ اند و اين سيستم ‌هاي شناسايي بسيار حساس مي ‌باشند، به نحوي كه براي كشت ‌هاي خوني كه از چنين سيستم هاي اتوماتيكي استفاده مي‌ كنند طول دوره بيش از 5 روز ضرورتي ندارد. به طور كلي،‌ ساب كالچر هـا (كشت‌ هـاي مجدد از كشت قبلي) تنها هنگامي انكوبه مي ‌شوند كه دستگاه، كشت را مثبت نشان دهد. سيستم‌ هاي كشت دستي منسوخ شده ‌اند و احتمالاً تنها در آزمايشگاه‌ هايي در كشور هاي در حال توسعه استفاده مي ‌شوند كه فاقد منابع براي خريد سيستم ‌هاي كشت اتوماتيك خون هستند. در سيستم ‌هاي دستي، بطري‌هاي كشت خون براي دو روز نخست، دو تا سه بار در روز، و پس از آن، براي 1 هفته، روزانه بررسي مي ‌شوند. در شيوه دستي، ساب كالچرهاي كور از تمامي بطري ‌هاي كشت خون در روز هاي دوم و هفتم ممكن است ضروري باشند.

    تعداد نمونه‌ هاي خوني كه بايد براي كشت ‌ها كشيده شوند و دوره زماني انجام آنها تا اندازه ‌اي به شدت بيماري باليني بستگي دارد. در عفونت‌ هاي بسيار حـاد، مانند سپتي سمي گرم منفي همـراه با شوك يا سپتي سمي استافيلوكوكي، به دست آوردن حداقل دو كشت خون از دو جايگاه آناتوميكي مختلف مناسب است. مقالات اخير پيشنهاد مي ‌دهند كه ممكن است 4-3 كشت خون لازم باشد. در ساير عفونت ‌هاي باكتريميک، مانند اندوكارديت حاد، بايد طي 24 ساعت سه نمونه خون به دست آيد. در بيش از 95% از بيماران مبتلا به باكتريمي، مجموعه‌ اي از سه كشت خون، باكتري‌ هاي عفونت ‌زا را ثمر مي ‌دهند. چنانچه سه كشت اوليه منفي گردند و آبسه ‌هاي نهفته، تب با منشأ ناشناخته، يا برخي عفونت ‌هاي نهفته ديگر مشكوك باشد، بايد كشت ‌هـاي خون اضافي، در صورت امكان قبل از شروع درمـان ضد ميكروبي، انجام شوند.

    انواع مختلفي از بطري ‌هـاي كشت خون در دسترس است كه حـاوي رِزين ‌ها يا ساير موادي ‌اند كه اكثر دار وهاي ضد ميكروبي و همچنين بعضي از فاكتور هاي ضد ميكروبي ميزبان را جذب مي ‌كنند. موارد مصرف براي بطري ‌هاي رزين ‌دار عبارتند از : بيماري كه از نظر باليني به عفونت دچار است و درمان ضد ميكروبي را دريافت كرده و در حال حاضر مجموعه ‌اي منفي از كشت‌ هاي خون دارد؛ بيماري كه مدركي باليني از اندوكارديت و كشت‌ هاي منفي خون داشته و درمان ضد ميكروبي را دريافت كرده است؛ و بيمار بستري شده در بيمارستان با ابتلا به سپتي سمي و دريافت درمان ضد ميكروبي پيش از بستري شدن. بطري ‌هاي رزين ‌دار نبايد پس از اثربخشي درمان استفاده شوند، زيرا رزين ممكن است تركيبات ضد ميكروبي حاضر در نمونه را جذب كند و كشت به رغم درمان باليني موثر، مثبت گردد.

    تعيين اهميت يك كشت خون مثبت ضرورت دارد. معيار هاي زير ممكن است در تمايز "مثبت‌ هاي حقيقي" از نمونه‌ هاي آلوده شده سودمند باشند :

 

  1. رشد همان ارگانيسم در كشت ‌هاي تكراري در زمان ‌هاي متفاوت از جايگاه‌ هاي آناتوميك مجـزا، قوياـً پيشنهاد بر باكتريميِ حقيقي مي ‌كند.
  2. رشد ارگانيسم ‌هاي متفاوت در بطري‌ هاي كشت متفاوت، آلودگي را پيشنهاد مي ‌دهد، اما گاه ممكن است آلودگي نتيجه ی مشكلات باليني نظير عفونت زخم يا پارگي روده باشد.
  3. رشد ميكروبيوتاي نرمال پوست، مانند استافيلوكوكوسهاي كوآگولاز منفي، ديفتروئيد ها (كورينـه باكتريوم و پروپيوني باكتريوم ‌ها)،  يا كوكوس ‌هاي گرم مثبت بي ‌هوازي، در تنها يكي از بطري‌ هاي كشت پيشنهاد دهنده آلودگي است. رشد چنين ارگانيسم‌ هايي در بيش از يك كشت يا از نمونه‌ هاي برگرفته از بيمار واجد پروتز عروقي يا سوند وريدي مركزي، احتمال وجود باكتريمي مهم از نظر باليني را افزايش مي ‌دهد.
  4. ارگـانيسم ‌هـايي از قبيل استرپتوكوكوس‌ هـاي ويريـدانس يـا انتروكوكوس‌ ها احتمالاً در كشت ‌هاي خون گرفته شده از بيماران مشكوك به اندوكارديت، و باسيل ‌هايي نظير اشريشياكولي احتمالاً در كشت‌ هاي خون گرفته شده از بيماران مبتلا به سپتي سمي باليني گـرم منفي رشد مي ‌كنند. از ايـن رو، هنگامي كـه چنين ارگانيسم‌ هاي "مورد انتظار" ي يافت شوند، آنها از نظر اتیولوژي اهميت بيشتري دارند.

 

    گونه‌هاي باكتريايي زير شايع‌ترين گونه‌هاي برداشت شونده در كشت‌ هاي مثبت خون هستند : استافيلوكوكوس ‌ها، از جمله استافيلوكوكوس اورئوس؛ استرپتوكوكوس ‌هـاي ويريدانس؛ انتروكوكوس ‌هـا، از جمله انتروكوكوس فكاليس؛ باكتري‌ هاي انتریک گرم منفي، از جمله اشرشياكولي و كلبسيئلا پنومونيه؛ پسودوموناس آئروژينوزا؛ پنوموكوكوس ‌ها؛ و هموفيلوس آنفولانزا. گونه ‌هاي كانديدا، ساير مخمر ها، و بعضي از قارچ ‌هاي دي مورفيك نظير هيستوپلاسما كپسولاتوم در كشت‌ هاي خون رشد مي‌ كنند، اما بسياري از قارچ‌ ها، اگر نگوييم هرگز، به ندرت از خون جدا مي‌ گردند. گاهي اوقات سايتومگالوويروس و هرپس سيمپلكس ويروس مي‌توانند از خون كشت شوند، اما اكثر ويـروس ‌ها و ريكتسيا ها و كلاميديا ها از خـون كشت نمي ‌شوند. تك ياخته ‌هاي انگلي و هلمنت ‌ها در كشت‌ هاي خون رشد نمي ‌كنند.

    در بسياري از انواع باكتريمي، بررسي اسمير هاي مستقيم خون سودمند نيست. بررسي جدي اسميـر هاي رنگ ‌آميزي شده گرم از بافي كُتِ برگرفته از خون آنتي كوآگوله، گاهي اوقات باكتري ‌ها را در بيماران مبتلا به عفونت استافيلوكوكوس اورئـوس، سپتي سمي كلستريديومي، يا تب راجعـه نشان خواهد داد. در بعضي از عفونت‌ هاي ميكروبي (مانند سياه زخم، طاعون، تب راجعه،‌ ريكتسيوزيس، لپتوسپيروزيس، اسپيريلوزيس، پسيتاكوزيس)، تلقيح خون در حيوانات ممكن است نسبت به كشت، نتايج مثبت را با سهولت بيشتري به دست بدهد. در عمل، اين كار هيچگاه در آزمايشگاه‌ هاي باليني انجام نمي شود.

 

ادرار

بررسي باكتريولوژيك ادرار عمدتاً هنگامي انجام مي‌پذيرد كه علائم يانشانه‌ها به عفونت دستگاه ادراي، نارسايي كليه، يا فشار خون بالا اشاره نمايند. اين بررسي بايد همواره براي اشخاص مشكوك به عفونت منتشره يا تب با منشأ ناشناخته انجام شود. چنين بررسي ‌اي براي زنان در سه ماهه نخست بارداري جهت ارزيابي باكتريوي (حضور باكتري در ادرار) بدون علامت، مطلوب است.

    ادرار ترشح شده در كليه استريل است، مگر آن كه كليه آلوده شده باشد. ادرار مثانه غير آلوده نيز به طور طبيعي استريل مي ‌باشد. اگرچه پيشابراه در بر دارنده ميكروبيوتاي نرمال است، به نحوي كه ادرار دفع شده‌ ي طبيعي واجد تعداد اندكي از باكتري ‌ها مي‌باشد. از آنجايي كه تشخيص ارگانيسم‌هاي آلوده كننده از ارگانيسم‌ هاي به لحاظ اتیولوژي مهم لازم است، تنها بررسي كمّي ادرار مي‌تواند نتايج معني‌دار را ثمر دهد.

    مراحل زير در بررسي صحيح ادرار ضروري ‌اند :

 

الف) جمع آوري صحيح نمونه

    جمع ‌آوري صحيح نمونه‌ تنها مرحله مهم در كشت ادرار و دشوار ترين آن است. نمونه ‌هاي رضايت بخش از زنان گيج كننده هستند.

 

  1. يك ظرف استريل با درب پيچ دار براي نمونه و دو تا سه اسفنج گاز آغشته به محلول نمكي (سالين) غير باكتريواستاتيك را برداريد (صابون ‌هاي‌ ضد باكتريايي براي پاكسازي توصيه نمي ‌شوند).
  2. لب‌ هاي فرج را با دو انگشت كشيده و آنها را در طول فرآيند پاكسازي و جمع ‌آوري باز نگه داريد. با هر گاز آغشته به سالين، پيشابراه را از جلو به عقب پاك نماييد.
  3. با استفاده از يك ظرف ادرار، نمونه ‌هاي ادرار را از جريان وسط جمع‌آوري كنيد. به ظرف برچسب صحيح بزنيد.

 

براي جمع‌آوري نمونه از مردان، شيوه مشابهي استفاده مي ‌شود.

    سوند گذاري (كاتتريزاسيون) خطر ورود ميكروارگانيسم ‌ها به مثانه را در پي دارد، اما گاهي اوقات اين عمل اجتناب ‌ناپذير است. توسط اورولوژيست با استفاده از يك سوند در سيتوسكوپي، از كليه ‌هاي راست و چپ، نمونه ‌هاي مجزا مي‌ توانند به دست آيند. هنگامي كه يك سوند يا سيستم جمع ‌آوري بسته قرار داده شود، ادرار بايد به واسطه مكش استريل از سوند با استفاده از سوزن و سرنگ به دست آيد، نه از كيسه جمع‌آوري ادرار. براي حل مشكلات تشخيصي، ادرار را مي ‌توان به طور آسپتيك با سوراخ کردن سوپراپوبيك ديواره شكم، مستقيماً مكش نمود [سوپراپوبيك : ناحيه بالاي تناسلي]. اين روش معمولاً در نوزدان انجام مي‌ شود.

    براي اكثر بررسي ‌ها mL 5/0 از ادرار پیشابراه یا mL 5 از ادرار دفع شده كافي است. از آنجايي كه بسياري از انواع ميكروارگانيسم‌ ها در دماي بدن يا در دماي اتاق به سرعت در ادرار تكثير مي‌ يابند، نمونه ‌هاي ادرار بايد سريعاً به آزمايشگاه تحويل داده شوند يا در يخچال (اما نه بيش از يك شب) قرار گيرند. همچنين، در صورتي كه نتوان نمونه‌ ها را در يخچال نگهداري كرد، انتقال با لوله ‌هاي حاوي اسيد بوريك مي‌ تواند سودمند باشد.

 

ب) بررسي ميكروسكوپي

از بررسي ساده ميكروسكوپي ادرار بيشتر مي ‌توان آموخت. قطره ‌اي از ادرار سانتريفيوژ نشده‌ ي تازه بر روي يك لام قرار داده شده و سطح آن با لامل پوشانده مي ‌شود، و با شدت نور محدود شده، تحت عدسي شيئي خشك در ميكروسكوپ باليني معمولي مي ‌توان گلبول سفيد، سلول‌ هاي اپيتليال، و باكتري ‌ها را چنانچه به تعداد بيش از mL/105 حضور داشته باشند، مشاهده نمود. يافتن 105 ارگانيسم در هر ميلي ‌ليتر در نمونه ادرارِ به درستي جمع‌آوري شده و به درستي بررسي شده، مدركي قوي حـاكي از عفونت فعال ادراري است. يك اسمير رنگ آميزي شده‌ ي گرم از ادرار سانتريفيوژ نشده از جريان وسط كه باسيل‌ هاي گرم منفي را نشان دهد، براي عفونت دستگاه ادراري ارزش تشخيصي دارد.

    سانتريفيوژ مختصر ادرار به آساني سلول‌ هاي چرك را رسوب مي‌ دهد، كه ممكن است همراه با باكتري ‌ها باشند و بنابراين ممكن است در تشخيص ميكروسكوپي عفونت كمك كنند. حضور ساير عناصر شكل گرفته در رسوب – يا وجود پروتئينوري (حضور پروتئين در ادرار) – كمك مستقيم اندكي در شناسايي اختصاصي عفونت فعال دستگاه ادراري مي ‌كند. سلول‌ هاي چرك ممكن است بدون باكتري ‌ها حضور داشته باشند، و، بالعكس، باكتری يوري (حضور باكتري در ادرار) ممكن است بدون پيوري (حضور چرك در ادرار) ديده شود. حضور سلول‌ هاي متعدد اپيتليال سنگفرشي، لاكتوباسيلوس‌ ها، يا فلور مخلوط در كشت نشان از جمع‌ آوري ناصحيح ادرار مي‌ دهد.

    برخي نوار هاي اندازه‌ گيري ادرار حاوي لکوسيت اِستراز و نيتريت هستند، و به ترتيب سلول ‌هاي پلي مورفونوكلئر و باكتري ‌ها را در ادرار اندازه‌ گيري مي ‌كنند.

    بسياري از آزمايشگاه‌ هاي شيمي براي آناليز ادرار از ابزار هاي اتوماتيك و نيمه اتوماتيك استفاده مي‌ كنند، اما اين ابزار ها در اغلب آزمايشگاه ‌هاي ميكـروبيولوژي باليني وجـود ندارند. براي شناسـايي گلبول‌ هـاي سفيـد و باكتري‌ ها توسط اين ابزار ها انواعي از تكنيك‌ ها مورد استفاده قرار مي‌گيرند. عملكرد اين سيستم‌ ها متفاوت است، اما سطحي از استانـدارد سازي را براي آزمايش حجم بالا فراهم مي ‌آورند كـه ممكن است با استفاده از روش‌ هاي نواري انجام نشود.

 

پ) كشت

كشت ادرار، براي آن كه معني ‌دار باشد، بايد به طور كمّي انجام گيرد. ادراري كه به درستي جمع ‌آوري شده است، در مقاديـر اندازه ‌گيري شده بر روي محيط‌ هاي جامد كشت مي ‌گردد، و كلني‌هايي كه پس از انكوباسيون نمايان مي ‌شوند، به منظور نشان دادن تعداد باكتري ‌ها در هر ميلي ‌ليتر، شمارش مي‌ شوند. روش معمول، گسترش mL 05/0 – 001/0 از ادرار رقيق نشده بر روي پليت‌ هاي بلاد آگار و ساير محيط ‌هاي جامد براي كشت كمّي است. تمام محيط‌ ها به مدت يك شب در C°37 انكوبه مي‌ شوند؛ آنگاه تراكم رشد با عكس‌هاي گرفته شده از تراكم ‌هاي متفاوت رشد براي باكتري‌هاي مشابه، مقايسه مي ‌گردد،‌ و داده‌ هاي نيمه كمّي به دست مي ‌آيند.

در پيیِلونفريت فعال، تعداد باكتري‌ ها در ادرار جمع آوري شده توسط سوند پيشابراهي نسبتاً پايين است. در حالي كه باكتري ‌هاي تجمع يافتـه در مثانه به سرعت تكثير پيدا كرده و به زودي به بيش از mL/105 مي ‌رسند – بسيار بيشتر از آنچه كه مي‌ تواند در نتيجه‌ ي آلودگي با ميكروبيوتاي پيشابراه يا پوست يا آلودگي از هوا وجود داشته باشد. از اين رو، به طور عموم اين توافق وجـود دارد كه چنانچه بيـش از mL/105 كلني، از نمونـه ادرار به درستي جمع ‌آوري شده و به درستي كشت شده به دست آيد، اين به منزله مدركي قوي حاكي از عفونت فعال دستگاه ادراري است. حضور 105 باكتري يا بيشتر از همان نوع در هر ميلي‌ ليتر در دو نمونه متوالي، تشخيص عفونت فعال دستگاه ادراري را تا 95% مطمئن مي ‌سازد. چنانچه باكتري‌هاي كمتري در كشت به دست آيند، بررسي مجدد ادرار براي نشان دادن حضور عفونت پيشنهاد مي ‌شود.

    حضور كمتر از 104  باكتري در هر ميلي ‌ليتر، از جمله چندين نوع مختلف از باكتري ‌ها، پيشنهاد مي‌ دهد كه ارگانيسم‌ ها از ميكروبيوتاي نرمال مي‌آيند و آلاينده ‌اند و معمولاً نتيجه‌ ي جمع ‌آوري نادرست نمونه مي ‌باشند. حضور mL/104 از نوع منفردي از باسيل گرم منفي انتریک قوياً پيشنهاد بر عفونت دستگاه ادراري به ويژه در مردان مي‌ كند. گاهي اوقات، زنان جوان مبتلا به سوزش ادرار و عفونت دستگاه ادراري mL 103-102 باكتري خواهند داشت. چنانچه كشت‌ ها منفي گردند، اما علائم باليني عفونت دستگاه ادراري وجود داشته باشند، "سندرم پيشابراه"، "انسداد پيشابراه"، "سل مثانه"، عفونت گونوكوكي، يا بيماري هاي ديگر بايد در نظر گرفته شوند.

 

مايع مغزي نخاعي

مننژيت در اورژانس‌ ها رتبه بالايي دارد، و تشخيص زودهنگام، سريع،‌ و دقيق آن حياتي است. تشخيص مننژيت به درصد بالاي مشكوك بودن، مطمئن بودن از نمونه‌ ها، و بررسي بي‌ درنگ نمونه‌ ها وابسته است. از آنجايي كه خطر مرگ يا آسيب برگشت ‌ناپذير بالا است، مگر آنكه درمان بلافاصله آغاز شده باشد، به ندرت شانس دومي براي به دست آوردن نمونه ‌هاي پيش از درمان وجود دارد، كه براي تشخيص اختصاصي عامل مسبب و مديريت بهينه ضروري ‌اند.

    فوري ‌ترين مسأله تشخيصي تمايز مننژيت باكتريايي چرك‌ دار از مننژيت غيرعفوني و گرانولوماتوس است. تصميم فوري معمولاً بر پايه شمارش سلول، غلظت گلوكز و محتواي پروتئين مايع مغزي نخاعي، و نتايج جستجوي ميكروسكوپي براي ميكروارگانيسم ‌ها گرفته مي ‌شود (مورد 1، فصل 48 را ببينيد). تصور اوليه با نتايج كشت، آزمون ‌هاي سرولوژيك، آزمون ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك و ساير فرآيند هاي آزمايشگاهي تغيير مي‌يابد. در ارزيابي نتايج حاصل از تعيين گلوكز مايع مغزي نخاعي، سطح همـزمان گلوكز خون بايـد در نظر گرفته شود. در برخي از نئوپلاسم ‌هاي سيستم عصبي مركزي، سطح گلوكز مايع مغزي نخاعي پايين است.

 

الف) نمونه‌ ها

به محض مشكوك شدن به عفونت سيستم عصبي مركزي، نمونه‌ هاي خون براي كشت گرفته مي ‌شوند و مايع مغزي نخاعي به دست مي ‌آيد. براي    به دست آوردن مايع مغزي نخاعي، با تكنيك دقيـق آسپتيك ناحيـه كمر سوراخ مي ‌شود. مايع مغزي نخاعي معمولاً در سه تا چهار بخش، هر كدام mL 5-2، در لوله‌ هاي استريل جمع ‌آوري مي ‌گردد. اين كار اجازه انجام راحت‌ تر و قابل اعتماد تر آزمون ‌ها براي تعيين چند مقدار متفاوتِ لازم جهت طرح يك دوره از عمل را مي‌ دهد.

 

ب) بررسي ميكروسكوپي

اسمير ها از رسوب مايع مغزي نخاعيِ سانتريفيوژ شده ساخته مي‌ شوند. براي آماده سازي لام‌ها جهت رنگ ‌آميزي، استفاده از سانتريفيوژ سيتوسپين توصيه مي ‌شود، زيرا اين سانتريفيوژ مواد سلولي و سلول ‌هاي باكتريايي را مؤثر تر از سانتريفيـوژ معمول تغليظ مي ‌نمايـد. اسمير هـا با رنگ‌ آميـزي گرم،‌ رنگ   ‌آميزي مي ‌شوند. مطالعه اسمير هـاي رنگ ‌آميزي شده تحـت عدسي شيئي روغن ايمرسيـون ممكن است ديپلوكوكوس ‌هـاي گرم منفيِ درون سلولي (مننگوكوكوس ‌ها)، ديپلوكوكوس‌هاي گرم مثبت درون سلولي و خارج سلوليِ لَنسِت مانند (پنوموكوكوس‌ ها)، يا باسيل ‌هاي گرم منفي كوچك (هموفيلوس آنفولانزا يا باسيل‌هاي گرم منفي انتریک) را نشان دهد.

 

پ) شناسايي آنتي ژن

آنتي ژن كريپتوكوكي در مايع مغزي نخاعي ممكن است با آگلوتيناسيون لاتكس يا آزمـون EIA شناسايي شود. آنتي ژن استرپتوكوكوس پنومونيه ممكن است با ايمونواسي غشا شناسايي گردد.

 

ت) كشت

شيوه ‌هاي كشتِ مورد استفاده بايد براي رشد ميكروارگانيسم ‌هايي كه اغلب در مننژيت ديده مي ‌شوند، مطلوب باشند. آگار خون گوسفند (بلاد آگار) و شكلات آگار با هم تقريباً تمام باكتري ‌ها و قارچ ‌هاي مسبب مننژيت را رشد مي‌ دهند. تشخيص مننژيت‌ هاي سلي مستلزم كشت روي محيط ‌هاي ويژه است (جـدول 2-47 و فصل 23 را ببينيد). در مننژيت غيـر عفوني يا مننگو انسفاليت، جدا سازي ويروس مي ‌تواند قصد شود. در عفونت ‌هاي ناشي از ويروس اوريون، مننژيت هرپس سيمپلكس، و ساير انتروويروس‌ ها، ويروس را مي ‌تـوان با موفقيت از مايع مغزي نخاعي جـدا كرد. با اين حـال، اكثر عفونت ‌هـاي ويروسيِ سيستم عصبي مركزي به بهترين وجه با شيوه‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك تشخيص داده مي‌ شوند.

 

ث) بررسي پي گيرانه ی مايع مغزي نخاعي

بازگشت سطح گلوكز مايع مغزي نخاعي و شمارش سلولي به حالت نرمال شاهد خوبي از درمان كافي است. اين پاسخ باليني از اهميت فوق‌ العاده‌اي برخوردار مي ‌باشد.

 

ترشحات تنفسي

علائم يا نشانه ‌ها اغلب به درگيري بخش خاص از دستگاه تنفسي اشاره دارند، و نمونه ‌ها بر اين اساس انتخاب مي‌شوند. در تفسير نتايج آزمايشگاهي، در نظر گرفتن ميكروبيوتاي نرمال از نواحي جمع‌ آوريِ نمونه ضروري است.

 

الف) نمونه‌ ها

1. حلق (گلو) اكثر "گلودرد ها" از عفونت ويروسي ناشي مي ‌شوند. تنها 10-5 درصد از گلودرد ها در بالغين و 20-15 درصد از آنها در كودكان، با عفونت هاي باكتريايي ارتباط دارند. يافتن ترشحات مايل به زرد يا يك غشاي مايـل به خاكستـري بايـد شك به حضور عفونت استرپتوكوكي β- هموليتيك گروه A، ديفتريايي، گونوكوكي، فوزو اسپيروكتالي، يا كانديديايي را برانگيزد. چنين نشانه‌ هايي ممكن است همچنين در مونو نوكلئوز عفوني، عفونت آدنوويروس، و ساير عفونت ‌هاي ويروسي وجود داشته باشند.

    سوآب ‌هاي حلق از هر ناحيه لوزه و از ديوراه خلفي حلق بدون تماس با زبان يا مخاط گونه گرفته مي ‌شوند. ميكروبيوتاي نرمال حلق عبارتند از : تعداد فراواني از استرپتوكوكوس‌ هـاي ويريدانس، نيسريا ها، ديفتروئيد ها، استافيلوكوكوس ‌ها، باسيل ‌هاي گرم منفي، ‌و بسياري از ارگانيسم ‌هاي ديگر. بررسي ميكروسكوپي اسمير های برگرفته از سوآب ‌هاي حلق در عفونت ‌هاي استرپتوكوكي ارزش كمي دارد، زيرا تمامي حلق ‌ها در بر دارنده فلور غالبي از استرپتوكوكوس‌ ها هستند.

    كشت‌ هـاي سوآب حلق زماني قابل اعتماد تـر اند كه بلافاصله پس از جمع ‌آوري تلقيح شده باشند. محيط ‌هاي انتخابي براي استرپتوكوكوس ‌ها را مي ‌توان جهت كشت استرپتوكوكوس ‌هاي گروه A به كار برد. در كشت خطي روي محيط‌ هاي انتخابي براي استرپتوكوكوس‌ها يا پليت‌ هاي بلاد آگار، گسترش يك تلقيح كوچك به طور كامل، و جلوگيري از رشد بيش از حد ميكروبيوتاي نرمال ضروري است. اين عمل مي ‌تواند به آساني با تماس دادن سوآب حلق به ناحيه كوچكي از پليت و استفاده از لوپ استريل باكتريولوژيك براي كشت خطي پليت از آن ناحيه انجام پذيـرد. شناسايي كلني‌ هاي β - هموليتيك با شكاف برداشتن آگارد (براي تأمين فشار كاهش يافته اكسيژن) و انكوباسيون پليت در دماي C°37 به مدت 2 روز، تسهيل مي‌شود.

    طي دو دهه گذشته، انواعي از آزمون‌ هاي شناسايي آنتي ژن، شيوه‌ هاي پروب، و آزمون‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك به منظور افزايش در تشخيص استـرپتوكوكوس پايوژنـز از سوآب حلق در بيمـاران مبتلا به فارنـژيت استرپتوكوكي حاد توسعه پيدا كرده ‌اند. در بسياري از شرايط، شيوه‌ هاي شناسايي سريـع به ‌سان كشت حساس نشان داده ‌انـد و در بسيـاري از آزمايشگاه‌ ها جانشين كشت گرديده‌ اند. اين مهم است كه كاربران بدانند كه تنها استپرتوكوكوس پايوژنز به واسطه چنين آزمون‌ هايي شناسايي يا مستثني خواهد شد، و بنابراين، آنها نمي‌ توانند براي تشخيص فارنژيت باكتريايي ناشي از ساير پاتوژن ‌ها به اين آزمون‌ ها تكيه كنند. يك الگوريتم (محاسبه عددي) عبارت است از : آغاز با يك آزمون سريع و ارسال براي كشت نمونه‌ هايي كه با آزمون‌ سريع منفي هستند.

 

2. نازوفارنكس نمونه‌ هـاي برگرفتـه از ناروفارنكس به نـدرت مطالعه مي‌ شوند، زيرا براي به دست آوردن آنها بايد از تكنيك‌ هاي ويژه استفاده نمود (بخش بعد، تشخيص عفونت ‌هاي ويروسي را ببينيد). سياه سرفه با كشت بوردتلا پرتوسيس از مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا بيني يا  به واسطه تقويت DNA بوردتلا پرتوسيس در نمونه توسط PCR تشخيص داده مي ‌شود.

 

3. گوش مياني  به ندرت از گوش مياني نمونه به دست مي ‌آيد، زيرا براي اين كار سوراخ كردن پرده گوش ضروري است. در عفونت گوش مياني، 50-30 درصد از مايعات كشيده شده از نظر باكتريولوژيك استريل ‌اند. باكتري‌هايي كه اغلب جدا مي ‌شوند، عبارتند از : پنوموكوكوس‌ها،‌ هموفيلوس آنفولانزا، موراكسلا كاتاراليس، و استرپتوكوكوس ‌هاي هموليتيك.

 

4. دستگاه تنفسي تحتاني ترشحات نايژه‌اي و ريوي اغلب با بررسي خلط مطالعه مي ‌شوند. گمـراه كننده‌ ترين جنبه از بررسي خلط، آلودگيِ تقريباً اجتناب ناپذير با بزاق و ميكروبيوتاي دهان است. بنابراين، يافتن كانديدا، استافيلوكوكوس اورئوس، يا حتي استرپتوكوكوس پنومونيه در خلط بيماران مبتلا به پنومونيت اهميت اتیولوژيكي ندارد، مگر آن كه با تصوير باليني پشتيباني شود. نمونه‌ هـاي معني ‌دار خلط بايـد از دستگاه تحتاني تنفسي           (با صاف كردن سينه) خارج شوند و بايد كاملاً از بزاق متمايـز گردند. حضور سلول ‌هاي متعدد اپيتليـال سنگفرشي پيشنهـاد بر آلودگي سنگين با بـزاق مي‌ كند؛ تعداد زياد گلبول‌ هاي سفيد پلي مورفونوكلئر (PMN)، ترشح چركي را پيشنهاد مي ‌دهد. با استنشاق چند دقيقه ‌ايِ اسپري آب نمك‌ هايپرتونيكِ حرارت ديده، خلط ممكن است القا شود. در پنوموني همراه با تراوش از پرده جنب، مايع جنب ممكن است به طور قابل اعتماد تري ارگانيسم‌ هاي مسبب را ثمر دهد. به هنگام مشكوك بودن به سل، زماني كه ماده از صاف كردن سينه به دست نمي ‌آيد، براي مثال در كودكان، مايع حاصل از شستشوي معده (خلط بلعيده شده) ممكن است ارگانيسم‌ ها را نشان دهد.

 

5. مكش از ناي، برونكوسكوپي، بيوپسي ريه، مايع حاصل از شستشوي نايژه و حبابچه ‌هاي ريه در اين نمونه‌ ها، غالباً ميكروبيوتا به درستی وقايع را در دستگاه تنفسي تحتاني بازتـاب مي ‌دهد. نمونه ‌هـاي به دست آمده از برونكوسكوپي ممكن است در تشخيص پنوموني پنوموسيستيس يا عفونت ناشي از لژيونلا يا سايـر ارگانيسم‌ هـا، ضروري باشند. نمونه ‌هاي حاصل از شستشوي نايژه و حبابچه‌ هـاي ريه به خصوص در بيماران واجد سیستم ايمني به خطر افتاده با ابتلا به پنوموني منتشر، سودمند هستند.

 

ب) بررسي ميكروسكوپي

اسمير هاي تهيه شده از رگه ‌هاي چركي يا گرانول‌ هاي خلط كه با روش رنگ‌ آميـزي گرم يا با شيوه اسيد - فست رنگ ‌آميـزي شده‌ انـد، ممكن است ارگانيسم ‌هـاي مسبب و PMN ها را آشكار سازند، آزمون مستقيم "كوئلانگ" براي پنوموكوكوس ‌ها را مي ‌توان با سرم پلي والان روي خلط تازه انجام داد.

 

پ) كشت

محيط ‌هاي مورد استفاده براي كشت خلط بايد براي رشد باكتري‌ ها (مانند پنوموكوكوس‌ ها، كلبسيئلا)، قارچ‌ها (مانند كوكسيديوئيدس ايميتس)، مايكو باكتريوم ‌ها (مانند مايكوباكتريوم توبركلوزيس)، و ساير ارگانيسم‌ ها مناسب باشند. نمونه‌ هاي به دست آمده از برونكوسكوپي و بيوپسي ريه بايد همچنين بر روي ديگر محيط‌ ها (به عنوان مثال، براي بي ‌هوازي‌ها، لژيونلا و سايرين) كشت شوند. شيوع نسبي ارگانيسم ‌هاي مختلف در نمونه بايد برآورد گردد. تنها يك يافته از يك ارگانيسم غالب يا جدا سازي همزمان يك ارگانيسم از خلط و خون مي‌ تواند به وضوح نقش آن را در پنوموني يا فرآيند چركي تصديق كند. در بيمارستان ‌هايي كه جمعيت دريافت كننده پيوند زياد است، آزمايشگاه‌ هـا اغلب الگوريتم‌ هـاي جامعي براي نمونه‌ هـاي به دست آمده توسط برونسكوسکوپ دارند، كه انواعي از شيوه‌ ها از جمله NAAT ها و ساير تكنيك‌ ها براي شناسايي گسترده پاتوژن، را شامل مي ‌شوند.

 

نمونه‌ هاي دستگاه گوارش

علائم حاد منتسب به دستگاه گوارش، به ويژه تهوع، استفراغ، و اسهال، معمولاً به عفونت نسبت داده مي‌ شوند. در واقع اکثر از اين حملات از عدم تحمل نسبت به غذا يا نوشيدني، انتروتوكسين‌ها، دارو ها يا بيماري های منتشره ناشي مي ‌شوند.

    بسياري از موارد اسهال عفوني حاد ناشي از ويروس‌هايي اند كه نمي‌توانند در كشت بافت رشد كنند. از سوي ديگر، بسياري از ويروس‌ها كه مي‌توانند در كشت رشد نمايند (مانند آدنوويروس‌ ها، انتروويروس ‌ها) قادر به رشد در روده، بدون ايجاد علائم گوارشي هستند. به طور مشابه، بعضي از پاتوژن‌ هاي باكتريايي ممكن است بعد از يك عفونت حاد، در روده باقي بمانند. بنابراين ممكن است اختصاص اهميت براي يك عامل باكتريايي يا ويروسيِ كشت شونده از مدفوع، به ويژه در بيماري تحت حاد يا مزمن، دشوار مي ‌باشد.

اين ملاحظات نبايد پزشك را از تلاش براي جـدا سازي آزمايشگـاهي ارگانيسم ‌هاي روده‌ اي دلسرد كنند، بلكه بايد هشداري از برخي مشكلات رايج در تفسير نتايج را تشكيل دهند.

    روده تحتاني به ميزان بسيار زياد در بر دارنده ميكروبيوتاي باكتريايي نرمال است. شايع ارگانيسم ‌ها بي ‌هوازي ‌ها (باكتروئيدز، باسيل ‌هاي گرم مثبت، و كوكوس ‌هاي گرم منفي)، ارگانيسم ‌هاي انتریک گرم منفي، و انتروكوكوس فكاليس هستند. هر كوششي براي برداشت باكتري ‌هاي پاتوژن از مدفوع مستلزم تفكيك پاتوژن ‌ها از ميكروبيوتاي نرمال، معمولاً از طريق استفاده از محيط ‌هـاي انتخـابي افتـراقي و غني سـازي كشت‌ هـا، است. عوامل مهم گاستـروانتريت حـاد عبارتند از : ويروس‌ هـا، توكسين‌ هـا (از استافيلوكوكوس ‌ها، كلستريديوم ‌ها، ويبريو ها، اشريشياكولي توكسيژنيک)، ‌باسيل‌هاي گرم منفي انتریک تهاجمي، تخميركنندگان آهسته لاكتوز، شيگلا و سالمونلا، و كمپيلوباكتر ‌ها. اهميت نسبي اين ارگانيسم‌ ها در بخش‌ هاي مختلف جهان به طور چشمگيري متفاوت است.

 

الف) نمونه ‌ها

مدفوع و سوآب ركتوم راحت ‌ترين نمونه ‌هـاي در دسترس هستند. صفـراي به دست آمده از تخليه دئودنوم ممكن است عفونت دستگاه صفراوي را نشان دهد. حضور خون، مخاط، يا كرم ‌ها بايد در بررسي كلي نمونه مورد توجه قرار گيرد. ديدن گلبول‌ هـاي سفيد در سوسپانسيون ‌هـاي مدفوع طي بـررسي ميكروسكوپي يا يافتن پروتئين لاكتوفرين مشتق شده از گلبول سفيد راه‌ هاي سودمندي جهت تمايـز اسهال تهاجمي از اسهال‌ هـاي عفوني غيـر تهاجمي هستند. با اين حال، بايد توجه نمود كه گلبول‌ هاي سفيد ممكن است در شرايـط التهابي و غيـر عفوني دستگـاه گوارش حضور داشته باشند. براي جستجـوي تك ‌ياخته ‌هـاي انگلي و كرم‌ هـا و تخم‌ هـاي آنها بايـد از تكنيك ‌هاي ويژه سود جست. اسمير هـاي رنگ‌ آميـزي شده ممكن است غالبيت گلبول‌هاي سفيد و برخي ميكروارگانيسم‌هاي غيرطبيعي، مانند كانديدا و استافيلوكوكوس‌ ها را نشان دهند، اما آنها را نمي ‌توان به منظور تمايـز پاتوژن ‌هاي باكتريايي روده‌ اي از ميكروبيوتاي نرمال به كار برد.

 

ب) كشت

نمونه‌ها در براث سوسپانسيون گرديده و بر روي محيط‌هاي معمولي، به علاوه محيط‌ هاي افتراقي (مانند مك كانكي آگار، EMB آگار) كه اجازه تفكيك باسيل ‌هـاي گرم منفي غيـر تخمير كننده لاكتوز را از ساير باكتري‌ هـاي روده ‌اي مي ‌دهند، كشت داده مي‌ شوند. چنانچه عفونت سالمونلا مشكوك باشد، نمونه همچنين پيش از كشت شدن بر روي محيط‌ هاي افتراقي (مانند هِكتون انتريك آگار يا شيگلا - سالمونلا آگار)، به مدت 18 سال در يك محيط غني شده (مانند سِلِنیت F براث) قرار مي ‌گيرد. پس از ذخيره سازي سوسپانسيون هاي مدفوعي در دماي C°4 به مدت 2 هفته، احتمال جدا سازي يرسينيا انتروكوليتيكا بيشتر است؛ اما اين ارگانيسم را مي ‌توان بر روي يرسينيا آگار يا شيگلا - سالمونلا آگار انكوبه شونده در دماي C°25 جدا ساخـت. ويبريو هـا بر روي تيوسولفات سيترات بایل سالتز سوكروز آگـار به بهترين وجه رشد مي ‌كنند. كمپيلوباكتري ‌هـاي ترموفيل (حرارت دوست) بر روي كمپي آگار يا محيط انتخابي اِسكيرو، انكوبه شده در دماي C°42-40 در 10 درصد CO2 با كاهش چشمگيـر در فشار O2، جـدا مي ‌گردنـد. كلني‌هاي باكتريايي با شيوه ‌هاي باكتريولوژيكي استاندارد شناسايي مي‌ شوند. آگلوتيناسيون باكتري ‌ها از كلني ‌هاي مشكوك توسط آنتي سرم اختصاصيِ مخلوط، سريع ‌ترين راه براي احراز حضور سالمونلا يا شيگلا در دستگاه گوارش است.

 

پ) شيوه‌ هاي غير كشت

EIA ها براي شناسايي پاتوژن‌هاي روده‌اي اختصاصي، مستقيماً در نمونه‌هاي مدفوع يا براي تأييد رشد در براث يا محيط‌ هاي پليت، در دسترس هستند. EIA هايي كه شيگا توكسين‌هاي 1 و 2 را در موارد مشكوك به كوليت ناشي از اشريشياكولي انتروهموراژيك (همچنين موسوم به اشريشياكولي توليد كننده شيگا توكسين يا STEC) مي ‌شناسند، در دسترس بوده و نسبت به كشت، ارجحيت دارند. همچنين EIA ها براي شناسايي مستقيم پاتوژن ‌هاي ويروسي، نظير روتاويروس، آدنوويروس ‌هاي 40 و 41، و نوروويروس‌ها؛ پاتوژن ‌هاي باكتريايي مانند كمپيلو باكترژژوني؛ و انگل‌ هاي تك ياخته ‌ايِ ژیاردیا لامبليا، كريپتوسپوريديوم پارووم، و انتامبا هيستوليتيكا در دسترس ‌اند. كارآيي اين سنجش ‌ها متفاوت است.

    انگل‌هاي روده‌اي و تخم‌هاي آنها با مطالعه ميكروسكوپي مكرر نمونه‌هاي تازه مدفوعي، كشف گرديده‌ اند. اين نمونه ‌ها به مديريت ويژه در آزمايشگاه نياز دارند (فصل 46 را ببينيد).

 

بيماري‌ هاي منتقل شونده جنسي

عوامل ترشح تناسلي پيشابراه در مردان عبارتند از: نيسريا گونوره، كلاميديا تراكـوماتيس، اورهآ پلاسما اورهآ ليتيكوم. اندوسِرويسيـت (سوزش غشـاي مخاطي در گردن رحم) در زنان از نيسريا گونوره و كلاميديا تراكوماتيس ناشي مي‌ شود. زخم‌ هاي تناسلي مرتبط با بيماري‌ ها هم در مردان و هم در زنان عبارتند از : غالباً هرپس سيمپلكس، به طور كمتر معمول سفليس يا شانكروئيد، و به طور نامعمول تورم مقاربتي غدد لنفاوي، و به ندرت گرانولوم كشاله ران. هر كدام از اين بيماري‌ ها تاريخچه طبيعي و تكامل ضايعات مخصوص به خود را دارند، اما هر يك مي ‌تواند به ديگري شبيه باشد. تشخيص آزمايشگاهي اكثر اين عفونت ‌ها در جاي ديگری از اين كتاب آمده است. چند آزمون تشخيصي در زير و در جدول 2-47 ذكر شده ‌اند.

 

الف) سوزاك

اسمير رنگ ‌آميزي شده از ترشح پيشابراه يا گردن رحم كه ديپلوكوكوس ‌هاي گـرم منفي درون سلولي را نشان دهد،‌ قويـاً سوزاك را پيشنهاد مي ‌دهـد. حساسيت اسمير براي مردان حدود 90% و براي زنان حدود 50% است. بنابراين، براي زنان، كشت يا آزمون تقويت اسيد نوكلئيك توصيه مي ‌شود. ترشحات، سوآب ركتوم، يا سوآب حلق بايد بي ‌درنگ بر روي محيط‌ هاي ويژه كشت شوند تا نيسريا گونوره را نتيجه دهند. براي شناسايي DNA ی نيسريا گونوره در ترشحات پيشابراه يا گردن رحم يا ادرار، شيوه‌ هاي ملكولي را مي ‌تـوان به كار بـرد، اما از شناسايي توالي ‌هـاي DNA ي نيسريا هاي غيـر پاتوژن ممكن است آزمـون ‌هـا به طور كاذب مثبت گردند و با نـوع پلت فرم های تجاري فرق كنند. آزمون‌ هاي سرولوژيك مفيد نيستند.

 

ب) عفونت ‌هاي تناسلي كلاميديايي

بخش بعدي در اين فصل، در قسمت تشخيص عفونت ‌هاي كلاميديايي ‌را ببينيد.

 

پ) هرپس (تبخال) تناسلي

فصل 33 و بخش بعدي در اين فصل، در قسمت تشخيص عفونت‌ هاي ويروسي را ببينيد.

 

ت) سفليس

بررسي زمينه تاريك يا ايمونو فلئورسنس مايع بافت از پايه شانكر ممكن است ترپونما پاليدوم شاخص را آشكار سازد. آزمون ‌هاي سرولوژيك براي سفليس 6-3 هفته بعد از عفونت مثبت مي ‌شوند. يك آزمون فلوكولاسيون مثبت (مانند VDRL يا PPR) به تأييد نياز دارد. يك آزمون آنتي بادي ترپونمايي ايمونو فلئورسنت مثبت (مانند FTA-ABS، آگلوتيناسيون ذره ترپونما پاليدوم [TP-PA]، يا EIA هاي جديد تر ترپونما و سنجش‌ هاي شميلومينسنس – فصل 42 را ببينيد) عفونت سفليس را اثبات مي‌ كند.

 

ث) شانكروئيد

اسمير هاي تهيه شده از يك ضايعه چركي معمولاً فلور باكتريايي مخلوط را نشان مي ‌دهند. سوآب‌ ها از ضايعات بايد در دماي C°33 و روي دو يا سه محيط كه براي هموفيلوس دوكریئي انتخابي ‌اند، كشت گردند. آزمون‌ هاي سرولوژيك مفيد نيستند. در برخي از آزمايشگاه‌ هاي مرجع و تحقيقاتي از سنجش ‌هاي ملكولي استفاده مي‌ شود.

 

ج) گرانولوم كشاله ران

كلبسيئلا (سابقاً كالیماتوباكتريوم) گرانولوماتيس، عامل مسبب اين ضايعه سخت، گرانولوماتوس، و پروليفراتيو، مي ‌تواند در محيط ‌هاي باكتريولوژيك پيچيده رشد كند، اما اين كار به ندرت سعي مي‌ شود و انجام موفقيت ‌آميز آن بسيار دشوار مي ‌باشد. اثبات هيستولوژيك "اجسام دونووان" داخل سلولی در ماده بيوپسي اغلب از تصور باليني پشتيباني مي ‌كند. آزمون‌ هاي سرولوژيك مفيد نيستند. در برخي از آزمايشگاه‌ هاي مرجع و تحقيقاتي از سنجش ‌هاي ملكولي استفاده مي ‌شود.

 

چ) واژينوز / واژينيت

واژينوز باكتريايي مرتبط با گاردنرلا واژيناليس يا موبيلونكوس (فصل 21 و مورد 13 در فصل 48 را ببينيد) با معاينه ترشحات واژن در اتاق بررسي تشخيص داده مي‌ شود؛ ترشحات (1) مايل به خاكستري و گاه‌ كف‌دار هستند، (2) pH بالاي 6/4 دارند، (3) هنگامي كه با هيدروكسيد پتاسيم قليايي شوند، بومي آمين ("مانند ماهي") مي ‌دهند، و (4) حاوي "سلول ‌هاي کليدي"، سلول‌هاي اپيتليال بزرگِ پوشيده شده با باسيل‌هاي گرم منفي يا گرم متغيير،  مي ‌باشند. مشاهدات مشابهي براي تشخيص عفونت تريكوموناس واژيناليس (فصل 46 را ببينيد) استفاده مي‌ شوند؛ ارگانيسم‌ هاي متحرك را مي ‌توان در لام‌ هاي مرطوب يا مواد كشت شده از ترشحات تناسلي ديد. پروب ‌هاي DNA و اخيراً NAAT‌ هاي به تأييد رسيده به مراتب حساس ‌تر از لام مرطوب هستند. واژينيت كانديدا آلبيكنس با يافتن هيف ‌هاي كاذب در نمونه آماده شده با هيدروكسيد پتاسيم، از ترشحات واژن، به واسطه پروب‌ ها، يا از طريق كشت تشخيص داده مي ‌شود.

 

عفونت ‌هاي بي ‌هوازي

اكثريت بزرگي از باكتري‌ هاي سازنده ميكروبيوتاي نرمال انسان بي ‌هوازي‌ها مي‌ باشند. بي‌ هوازي‌ ها هنگامي كه از جايگاه‌ هاي طبيعي خود به بافت‌ ها يا فضاهاي بدن جا به‌ جا شوند، ممكن است بيماري ايجاد كنند. برخي ويژگي‌ها پشنهاد بر عفونت‌ هاي بي ‌هوازي مي ‌دهند : (1) آنها اغلب با سطح مخاطي پيوستگي دارند. (2) آنها معمولاً مخلوطي از ارگانيسم‌ ها را شامل مي‌ شوند. (3) آنها تمايل به ايجاد عفونت ‌هاي فضاي بسته، مانند آبسه‌ هاي مجزا (ريه، مغز، جنب، صفاق، ‌لگن) يا پنهان شدن در زير لايه‌ هـاي بافت دارند. (4) چرك از عفونت ‌هاي بي‌ هوازي غالباً بوي بدي دارد. (5) اكثر بي ‌هوازي‌هاي مهم از نظر پاتوژني، به استثناي باكتروئيدز و برخي گونه ‌هاي پرووتلا به پني ‌سيلين G بسيار حساس‌ اند. (6) عفونت‌ هاي بي ‌هوازي با خون‌رساني كاهش يافته، بافت نكروزه، و پتانسيل اكسيداسيون - احياي پايين كه همگي همچنين در تحويل داروهاي ضد ميكروبي اختلال ايجاد مي‌كنند، به موفقيت مي‌ رسند. (7) براي جدا سازي ارگانيسم‌ها شيوه ‌هاي جمع ‌آوري، محيط‌ هاي انتقال، و تكنيك‌ هـا و محيط‌ هاي بي‌ هوازي و انتخـابي خاص لازم است.  در غير اين‌صورت،‌ بررسي باكتريولوژيك ممكن است منفي باشد يا فقط هوازي‌ هاي اتفاقي را ثمر دهد (همچنين فصل 21 را ببينيد).

    جايگاه ‌هاي زير، مكان‌ هاي عفونت‌ هاي مهم بي ‌هوازي هستند.

 

دستگاه تنفسي

عفونت‌هاي پيرامون دندان، آبسه‌هاي پيرامون دهان، سينوزيت و ماستوئيديت (التهاب زائده پستاني) ممكن است عمدتاً ناشي از پرووتلا ملانينوژنيكا، فوزوباكتريوم، و پپتو استرپتوكوكوس‌ ها باشند. استنشاق محتويات دهان به ريه ممكن است به پنوموني نكروز دهنده، آبسه ريه، و آمپيِم (تجمع چرك در فضاي پرده جنب) بيانجامد. دارو هاي ضد ميكروبي، تخليه وضعيتي، و تخليه با جراحي براي درمان ضروري ‌اند.

 

سيستم عصبي مركزي

بي ‌هوازي‌ ها به ندرت موجب مننژيت مي‌ شوند، اما آنها عوامل شايع آبسه مغز، آمپيم ساب دورال، و ترومبوفِلِبيت (بلوكه شدن يك يا چند رگ توسط لخته خون) هستند. اين ارگانيسم‌ ها معمولاً از دستگاه تنفسي منشأ گرفته و از راه گسترش يا از راه خون به مغز مي‌ رسند.

 

عفونت ‌هاي درون شكمي و لگن

ميكروبيوتاي روده بزرگ عمدتاً متشكل از بي ‌هوازي‌ ها، 1011 در هر گرم از مدفوع است. باكتروئيدز فراژيليس، كلستريديوم‌ ها، و پپتو استرپتوكوك‌ ها نقش مهمي را در شكل ‌گيـري آبسه‌ هاي منشأ گرفتـه از سوراخ شدن ايفا مي ‌كنند. پرووتلا بيویيا و پرووتلا ديسایئنس در آبسه‌ هاي لگن، منشأ گرفته از اندام تناسلي زنان اهميت دارند. اين گونه‌ ها به سان باكتروئيدز فراژيليس، اغلب به پني‌ سيلين نسبتاً مقاوم ‌اند، از اين رو كليندامايسين، مترونيدازول، يا عامل مؤثر ديگري بايد استفاده شود.

 

عفونت ‌هاي پوست و بافت نرم

بي‌ هوازي‌ ها و باكتري‌ هاي هوازي اغلب به هم پيوسته،‌ عفونت ‌هاي سينرژيستيك يا هميارانه (قانقاريا،‌ فسيئيت نكروز دهنده،‌ سلوليت) را موجب مي‌ گردند. تخليه از طريق جراحي،‌ برش، و بهبود جريان خون مهم‌ ترين اشكال درمان هستند، در حالي كه دارو هاي ضد ميكروبي به عنوان كمك‌ كننده عمل مي ‌نمايند. اشاره دقيق به يك ارگانيسم خاص به عنوان مسئول ضايعه ی پيشرونده دشوار است، زيرا مخلوطي از ارگانيسم ‌ها درگير مي ‌باشد.

 

تشخيص عفونت ‌هاي كلاميديايي

اگرچه كلاميديا تراكوماتيس، كلاميدوفيلاپنومونيه، ‌و كلاميديا پسيتاسي باكتري ‌اند، آنها انگل ‌هاي درون اجباري به شمار مي ‌روند. كشت ‌ها و ساير آزمون‌ هاي تشخيصي براي كلاميديا ها به فرآيند هايي نياز دارند كه به فرآيند هاي مورد استفاده در آزمايشگاه‌ هاي ويروس شناسي بسيار شبيه ‌اند، به جاي آنكه به فرآيند هاي مورد استفاده در آزمايشگاه‌ هاي باكتري شناسي و قارچ شناسي شبـاهت داشته باشند. بنابرايـن، تشخيص عفونت‌ هـاي كلاميديايي در بخش مجزايي از اين فصل بحث شده است. تشخيص آزمايشگاهي عفونت ‌هـاي كلاميديايي همچنین در فصل 27 بحث گرديده است.

 

نمونه‌ ها

براي عفونت‌ هاي چشمي و تناسلي كلاميديا تراكوماتيس، نمونه ‌ها جهت بررسي مستقيم يا كشت بايد با سوآب‌ كشي شديد يا خراش دادن سطح سلول اپيتليال جمع‌ آوري گردنـد. كشت‌ هـا يا ترشحـات چركي كافي نيستند، و مواد چركي بايد پيش از به دست آوردن نمونه پاک شوند. بنابراين براي كونژكتيويت (التهاب ملتحمه) انكلوژن، مواد حاصل از خـراش ملتحمه به دست مي ‌آيد؛ براي اورِتريت (التهاب پيشابراه)، نمونه سوآب از چند سانتي متري درون پيشابراه گرفته مي ‌شود؛ و براي سِرويسيت (التهاب گردن رحم) نمونه از سطح سلول ستـوني كانـال داخلي گردن رحـم به دست مي‌ آيد. نمونه‌ هاي سوآب يا ادرار ممكن است براي آزمون‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك مورد استفاده قرار گيرند. هنگامي كه عفونت دستگاه تناسلي فوقاني در زنان مشكوك باشد، خراش دادن اندومِتر (غشاي مخاطي داخلي رحم) نمونه خوبي را ارائـه مي ‌دهد. مايع به دست آمده از طريـق كولدوسِنتزيس يـا مكش از لوله رحم، بازده اندكي براي كلاميديا تراكوماتيس روي كشت دارد [culdocentesis : فرآيندي پزشكي كه طي آن به كمك سوزن از حفره پريتونئوم بين ركتوم و ديواره خلفي رحم مايع برداشت مي ‌شود].

    براي كلاميدوفيلا پنومونيه، نمونه‌ هاي سوآب نازوفارنكس (و نه حلق) استفاده مي‌ شوند.

    براي تورم مقاربتي غدد لنفاوي، مكش از خيارك ‌ها يا گرهك ‌ها بهترين نمونه را براي كشت فراهم مي ‌آورد.

    براي پسيتاكوزيس، كشت خلط، خون، يا مواد بيوپسي ممكن است كلاميديا پسيتاسي را ثمر دهد. اين عمل به طور معمول در آزمايشگاه‌ هـاي باليني انجام نمي ‌پذيرد، زيرا هم به شيوه ‌هاي تخصصي شده نياز دارد، و هم براي كاركنان آزمايشگاه مخاطره ‌آميز مي‌ باشد.

سوآب‌ ها، مواد حاصل از خراش، و نمونه‌ هاي بافت را بايد در محيط ‌هاي انتقال قرارداد. يك محيط مفيد، mol/L 2/0 سوكروز در M 02/0 بافر فسفات، 2/7 – 0/7 = pH، با 5% سرم جنين گوساله دارد. ساير محيط‌ هاي انتقال ممكن است به همان اندازه مناسب باشند. محيط انتقال بايد در بر دارنده آنتي بيوتيك‌ ها براي سركوب باكتري ‌هاي غير از گونه ‌هاي كلاميديا باشد. جنتامايسين، mL/μg10، ونكومايسين، mL/μg100، و آمفوتريسين B،mL/μg4، در تركيب با هم، مي ‌توانند استفاده شوند، زيرا كلاميديا را مهار نمي‌ سازند. چنانچه نتوان سريعاً گونه ‌ها را پردازش نمود، مي ‌توان آنها را به مدت 24 ساعت در يخچال نگهداري كرد؛ در غير اين‌ صورت، تا هنگام پردازش، آنها بايد در دماي C°60- يا سرد تر منجمد گردند.

 

بررسي با ميكروسكوپ و رنگ‌ آميزي

بررسي سيتولوژيك تنها براي مواد حاصل از خراش دادن ملتحمه چشم جهت تشخيص التهاب ملتحمه انكلوژن و تراخم ناشي از كلاميديا تراكوماتيس مهم و مفيد است. به طور كلاسيك، با نمونه‌ هاي رنگ ‌آميزي شده باگيمسا، انكلوژن‌ هاي درون سيتوپلاسمي شاخص را مي ‌توان ديد. آنتي ‌بادي ‌هاي مونوكلونال كونژوگه با فلئورسئين را مي‌توان براي بررسي مستقيم نمونه‌ هاي برگرفته از دستگاه تناسلي و نمونه ‌هاي چشمي به كار برد، اما آنها به اندازه كشت كلاميديايي يا آزمون ‌هاي تشخيصي ملكولي حساس نيستند.

 

كشت

براي جدا سازي گونه‌ هاي كلاميديا، زماني كه كشت لازم باشد، تكنيك‌ هاي كشت سلولي توصيه مي ‌شوند. كشت سلولي براي كلاميديا تراكوماتيس و كلاميديا پسيتاسي معمولاً مستلزم تلقيح نمونه‌ هاي باليني در سلول ‌هاي McCoy ی مواجه شده با سيكلو هگزاميد است، در حالي كه كلاميدوفيلا پنومونيه به سلول هاي از پيش مواجه شده‌ ي HL يا HEP-2 نياز دارد. يك تكنيك از رشد متلاقيِ سلول‌ هاي McCoy (مك كوي) روي لامل‌ هاي 13 ميلي متري در وِيال‌ هاي يك بار مصرف كوچك بهره مي ‌برد. تلقيح در ويال‌ هاي تكراري قرار مي ‌گيرد، و تقريباً در g × 3000 بر روي مونولاير ها سانتريفيوژ مي ‌شود و به دنبال آن، 72-48 ساعت انكوباسيـون در دماي C°35 و رنگ ‌آميزي انجام مي ‌پذيرد. جهت شناسايي كلاميديا تراكوماتيس،‌ از رنگ ‌آميزي ايمونو فلئورسنس، گيمسا، يا رنگ ‌آميزي يُد به منظور جستجو براي انكلوژن‌ هاي درون سيتوپلاسمي استفاده مي ‌شود. تكنيك ‌هاي ايمونو فلئورسنت از ميان سه رنگ ‌آميزي فوق، از همه حساس ‌تر اند، اما به شناساگر IF و ميكروسكوپ ويژه نياز دارند. گيمسا نسبت به يد حساس ‌تر است، اما بررسي ميكروسكوپي با آن دشوار تر مي‌ باشد.

    در تكنيك دوم كشت، از سلول‌هاي McCoy در پليت ‌هاي ميكرو رقت 96 چاهك دار و رنگ‌ آميـزي يد يا فلئورسنت آنتي بـادي استفاده مي ‌شود. از آنجايي كه مساحت سطح مونولاير كمتر و تلقيح كوچك ‌تر است، روش پليت ميكرو رقت نسبت به تكنيك لامل - ويال كمتر حساس مي ‌باشد.

    انكلوژن ‌هاي كلاميديا تراكوماتيس با يد رنگ مي ‌پذيرند، اما انكلوژن‌هاي كلاميدوفيلا پنومونيه يا كلاميديا پسيتاسي اين چنين نيستند (فصل 27 را ببينيد). اين دو گونه به واسطه پاسخ متفاوت خود به يد و حساسيت به سولفوناميد از كلاميديا تراكوماتيس متمايز مي ‌گردند. كلاميدوفيلا پنومونيه در كشت مي ‌تواند با استفاده از آنتي بادي مونوكلونال اختصاصي به گونه شناسايي شود. تكنيك ‌هاي سرولوژيك براي تمايز گونه‌ ها عملي نيستند، اگرچه كلاميديا تراكوماتيس مي ‌تواند با شيوه ميكرو ايمونو فلئورسنت تعيين نوع شود.

 

شناسايي آنتي ژن و هيبريديزاسيون اسيد نوكلئيك

براي شناسايي آنتي ژن‌هاي كلاميديايي در نمونه‌هاي دستگاه تناسلي بيماران مبتلا به بيماري ‌هاي مقاربتي، ديگر EIA ها توصيه نمي ‌شوند. EIA ها در مقايسه با NAAT هاي حساس‌تر براي كلاميديا (ادامه را ببينيد) حساسيت بسيار كمتري دارند. براي آزمايش برخي از نمونه‌ هاي برگرفته از جايگاه‌ هاي غير تناسلي نظير ملتحمه در نوزادان، ممكن است آزمون فلئورسنت آنتي بادي مستقيم با DFA (direct fluorescent antibody) همچنان مفيد باشد. كيت‌ هاي تجاري با پروب‌هاي ملكولي غير راديو ايزوتوپيك و تقويت نشده براي توالي ‌هاي RNA ي S16 كلاميديا تراكوماتيس جهت شناسايي مستقيم كلاميديا تراكوماتيس در نمونه ‌هاي باليني به بازار عرضه شده ‌اند. حساسيت و اختصاصيت كلي اين شيوه به ترتيب 85 و 99-98 درصد است. آزمـون‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك نيز تـوسعه پيدا كرده و به بازار عرضه شده ‌اند. اين سنجش‌ ها بر پايه PCR، تقويت با واسطه رونويسي يا تقويت جابجايي رشته هستند. اين آزمون ‌ها نسبت به كشت يا سايـر آزمون‌ هـاي غير تقويتي كه نيازمند بازتعريف حساسيت در مستندات آزمايشگاهي عفونت كلاميديايي مي ‌باشند، به مراتب حساس ‌تر اند. به نظر مي ‌رسد اختصاصيت اين آزمون ‌ها نزديك به 100% باشد (فصل 27 را ببينيد).

 

سرولوژي

آزمون تثبيت كمپلمان يا CF (complement fixation) به طور گسترده براي تشخيص پسيتاكوزيس به كار مي ‌رود تشخيص عفونت‌ هاي كلاميديايي در فصل 27 بحث گرديده اند.

    براي اندازه‌ گيري آنتي ‌بادي ‌هاي ضد كلاميديايي، شيوه ميكرو ايمونو فلئورسنس حساس‌تر از CF است. تيتر آنتي بادي ‌هاي Ig (ايمونوگلوبولين) G هنگامي كه در سرم‌ هاي حاد و نقاهت افزايش چهار برابري ديده شود، مي ‌تواند ارزش تشخيصي داشته باشد. اگرچه، به دليل تيتر پس زمينه بالا در جمعيت فعال از نظر جنسي، نشان دادن افزايش در تيتر IgG ممكن است دشوار باشد. اندازه‌گيري آنتي‌بادي‌ هاي IgM در تشخيص پنوموني كلاميديا تراكوماتيس در نوزادان به طور ويژه مفيد است. نوزادان متولد شده از مادران مبتلا به عفونت ‌هاي كلاميديايي داراي آنتي‌بادي‌ هاي ضد كلاميديايي IgG سرم از جريان خون مادر هستند. نوزادان مبتلا به عفونت‌ هاي چشمي يا دستگاه تنفسي فوقاني از تيتر پاييني از IgM ضد كلاميديايي برخوردار اند، در حالي كه نوزادان مبتلا به پنوموني كلاميدياي تيتر IgM 32 : 1 يا بيشتر دارند.

 

تشخيص عفونت‌ هاي ويروسي

ويروس ‌شناسي پزشكي نيازمند ارتباط ميان پزشك و آزمايشگاه است و به كيفيت نمونه‌ ها و اطلاعات عرضه شده به آزمايشگاه بستگي دارد.

    انتخاب روش ‌ها براي تأييد آزمايشگاهيِ يك عفونت ويروسي به مرحله بيماري وابسته است (جدول 4-47). آزمون‌ هاي آنتي بادي به نمونه‌ هاي گرفته شده در فواصل مناسب نياز داشته، و تشخيص، اغلب تا دوره نقاهت به تأييد نمي ‌رسد. جدا سازي ويروس، شناسايي آنتي ژن يا NAAT لازم است : (1) هنگامي كه اپيدمي‌ هاي جديد، براي مثال با آنفولانزا رخ دهند؛ (2) هنگامي كه آزمون ‌هاي سرولوژيك سودمند نيستند؛ (3) هنگامي كه بيماري بالينيِ مشابـه ممكن است توسط بسيـاري از عوامل مختلف ايجـاد شود. برای مثال، مننژیت غیـر عفونی (غیـر باکتریایی) ممکن است از بسیـاری از ویروس های مختلف ناشی گردد؛ به طور مشابه، سندرم های بیماری تنفسی ممکن توسط بسیاری از ویروس های مختلف، به علاوه مایکوپلاسما هـا و سایر عوامل پدید آید.

    شيوه‌هاي تشخيصي مبتني بر تکنیک‌هاي تقويت‌ اسيد نوكلئيك جايگزين اكثر (اما نه همه ‌ي) روش ‌هاي كشت ويروس شده ‌اند. اگرچه، نياز به جمع ‌آوري مناسب نمونه و تفسير آزمون تغيير نخواهد كرد. وانگهي، هنگامي كه برداشت عامل عفونت ‌زا مورد نظر باشد، زمان وجود خواهد داشت.

    جدا سازي يك ويروس ممكن است عامل يك بيماري معلوم را معين نكند. بسياري از عوامل  ديگر بايد در نظر گرفته شوند. بعضي از ويروس ‌ها در ميزبان‌ هاي انساني براي دوره‌ هاي طولاني از زمان باقي مي ‌مانند، و از اين رو، جداسازي هرپس ويروس‌ها، پوليوويروس، اكوويروس‌ها، يا كوكساكي ويروس‌ها از يك بيمار با بيماري ناشناخته ثابت نمي‌كند كه آن ويروس عامل آن بيماري است. پیش از آن که یک عامل خاص به عنوان مسئول تصویر بالینی خاص تعیین شود، الگوی سازگار بالینی و اپیدمیولوژیکی باید مبنا قرار گیرد.

 

جدول 4-47. ارتباط مرحله بيماري با حضور ويروس در مواد آزمايش و با نمايان شدن آنتي بادي اختصاصي

مرحله يا دوره بيماري

ويروس قابل شناسايي در مواد آزمايش

آنتي بادي اختصاصي قابل اثباتa

كمون

به ندرت

خير

علائم اوليه

گاهي

خير

آغاز

غالباً

گاهي

حاد

غالباً

غالباً

بهبود

به ندرت

معمولاً

نقاهت

بسيار به ندرت

معمولاً

 

a. در اشخاصي كه سابقاً واكسينه شده ‌اند، آنتي بادي ممكن است بسيار زود شناسايي شود.

 

    در جريان روز هاي نخست بيماري، بسياري از ويروس‌ ها به سهولت جدا مي ‌شوند، نمونه ‌هايي كه بايد در تلاش ‌ها براي جدا سازي ويروس مورد استفاده قرار گيرند، در جدول 5-47 ذكر شده ‌اند. ارتباط جدا سازي ويروس و حضور آنتي بادي در دستيابي به تشخيص كمك مي ‌كند، اما به ندرت استفاده مي‌ شود.

نمونه ‌ها را مي ‌توان قبل از انجام كشت ويروس، تا 24 ساعت در يخچال نگهداري كرد؛ استثناء ويروس سين سيشيال تنفسي و برخي ديگر از ويروسها است. در غير اين‌ صورت، چنانچه در بردن مواد به آزمايشگاه يك روز تأخير وجود داشته باشد، بايد آن را (ترجيحاً در C°60- يا سرد تر) منجمد ساخت. نمونه ‌هايي كه نبايد منجمد شوند عبارتند از : (1) خون كامل كشيده براي تعيين آنتي بادي، كه پيش از انجماد، سرم بايد از آن تفكيك گردد؛ و (2) بافت براي كشت سلولي، كه بايد در C°4 نگه داشته شده و بي‌ درنگ به آزمايشگاه برده شود.

    در بيماري ‌هاي تنفسي، ويروس در ترشحات حلق يا بيني حضور دارد. ويروس را مي ‌توان در مايع برگرفته از حلق و مواد حاصل از خراش دادن پايه بثورات وزيكولي به اثبات رساند. در عفونت‌ هاي چشم، ويروس در سوآب‌هاي ملتحمه يا مـواد حاصل از خراش دادن و در اشك قابل شناسايي است. انسفاليت‌ ها معمولاً از طريق سرولوژيك يا شيوه‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك به آساني تشخيص داده مي ‌شوند. آربوويروس‌ ها و هرپس ويروس‌ ها معمولاً از مايع نخاعي به دست نمي ‌آيند، اما بافت مغز بيماران مبتلا به انسفاليت ويروسي ممكن است ويروس مسبب را ثمر دهد. در بيماري ‌هاي مرتبط با انتروويروس‌ هـا، نظير بيماري سيستم عصبي مركزي، پري كارديت حـاد،‌ و ميوكارديت، ويروس‌ها را مي‌توان از مدفوع، سوآب حلق، يا مايع مغزي نخاعي جدا است. با این حال، همچنان که در بالا گفته شد، NAAT شیوه ای ارجح برای تشخیص انتروویروس ها در مايع مغزي نخاعي است.  آزمون ‌هاي فلئورسنت آنتي بادي ممكن است براي شناسايي عفونت دستگاه تنفسي با ويروس سين سيشيال تنفسي، ويروس ‌هاي آنفولانزا A و B  ويروس ‌هاي پارا آنفولانزا و آدنوويروس‌ ها به سان كشت حساس باشند. اين آزمون ‌ها پاسخ ‌ها را، در مقايسه با چند روز براي كشت ويروس، طي چند ساعت پس از جمع ‌آوري در اختيار مي‌ گذارند. هرچند، اين شيوه‌ هاي شناسايي آنتي ‌ژن به آهستگي جايگزين فن ‌آوري ‌هاي به همان اندازه سريع PCR زمان واقعي و ميكرواَرِي (كه اجازه شناسايي همزمان انواعي از ويروس‌ هاي مورد نظر را مي ‌دهند) می شوند.

 

 

جدول 5-47. عفونت ‌هاي ويروسي : عوامل، نمونه‌ ها، و آزمون ‌هاي تشخيصي

سندرم و ويروس

نمونه

سيستم شناسايي

توضيحات

بيماري‌ هاي تنفسي

 

 

ويروس‌ هاي آنفولانزا

 

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا سوآب از نازوفارنكس، خلط،

نمونه‌ هاي تنفسي به دست آمده به طور درون كار

 

كشت سلولي (PMK، MDCK)، تخم ‌مرغ‌ هاي جنين دار،

 FA مستقيم، EIA، و NAAT ها

ويروس به واسطه هِم اَدزورپشن گلبول‌هاي قرمز خوكچه‌هاي هندي در 4-2 روز شناسايي مي ‌شود. HI يا IF براي شناسايي ويروس به كار مي‌ روند، شناسايي آنتي ژن توسط DFA؛ NAAT ها در دسترس بوده و جانشين ساير روش ‌ها می شوند.

 

 

 

ويروس‌ هاي پاراآنفولانزا

 

 

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا سوآب از نازوفارنكس، خلط

 

 

كشت سلولي (PMK، LLC-MK2) FA مستقيم، تقويت اسيد نوكلئيك

ويروس به واسطه هِم ادزورپشن گلبول‌هاي قرمز خوكچه هندي در 7-4 روز شناسايي مي‌شود HI، IF و HAI براي شناسايي ويروس به كار مي ‌روند؛ NAAT ها در دسترس بوده و جايگزين ساير روش‌ها می شوند.

 

 

ويروس سين سيشيال تنفسي

 

 

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس

 

كشت سلولي

(HEL، HeLa، HEp-2

 FA مستقيم، تقويت اسيد نوكلئيك

CPE معمولاً در 7-1 روز نمايان مي ‌شود. شناسايي آنتي ژن توسط EIA، DFA؛ NAAT ها در دسترس بوده و جايگزين ساير

روش‌ ها می شوند.

 

 

آدنوويروس

 

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا سوآب از نازوفارنكس، مدفوع، سوآب ملتحمه

 

كشت سلولي (HEp-2، HEK

 FA مستقيم، تقويت اسيد نوكلئيك، EIA براي آدنوويروس ‌هاي روده ‌اي

CPE معمولاً در 7-3 رو نمايان

مي ‌شود. IF براي شناسايي ويروس به كار مي ‌رود. NAAT ها در دسترس بوده و جايگزين ساير

روش‌ ها می شوند.

رينوويروس ‌ها

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا سوآب از نازوفارنكس

كشت سلولي (HEL

تقويت اسيد نوكلئيك

NAAT ها در دسترس بوده و جايگزين ساير روش ‌ها می شوند.

 

انتروويروس ‌ها

 

مايع حاصل از شستشوي نازوفارنكس يا سوآب از نازوفارنكس، مدفوع

 

كشت سلولي (PMK، HEL

تقويت اسيد نوكلئيك

كوكساكي ويروس A به ندرت در كشت بافت رشد مي ‌كند؛

 NAAT ها براي عفونت ‌هاي سيستم عصبي مركزي ارجح هستند.

بيماري ‌هاي تب ‌دار

 

 

 

دانگ،

ساير آربوويروس ‌ها

 

 

 

سرم، CSF، نمونه‌ هاي اتوپسي، ناقل (پشه آئدِس)

 

 

موش‌ هاي شيرخوار،

كشت سلولي (وِرو)

بسياري از ويروس ‌ها در اين گروه شديداً عفونت ‌زا بوده و به سهولت به كاركنان آزمايشگاه انتقال

مي‌ يابند. بعضي از آنها فقط در آزمايشگاه‌ هاي مجهز بايد مطالعه شوند. سرولوژي مورد استفاده قرار مي‌ گيرد.

تب ‌هاي خونريزي دهنده

فصل 38 را ببينيد

سرم، خون

موش ‌هاي شيرخوار،

كشت سلولي (ورو)

توضيح مربوط به بيماري ‌هاي

تب دار را ببينيد.

LCM

 

ويروس LCM

 

خون ،CSF

كشت سلولي (ورو، BHK

موش‌ هاي شيرخوار

IF و نوتراليزاسيون در موش ‌ها براي شناسايي ويروس به كار

مي ‌روند، سرولوژي؛ NAAT‌ ها.

تب لاسا

ويروس لاسا

خون، سوآب از نازوفارنكس،‌ ترشحات

كشت سلولي (ورو، BHK)

جدا سازي ويروس لاسا به آزمايشگاه ‌هاي مجهز محدود مي‌شود؛ سرولوژي؛ NAAT ها

انسفاليت

آربوويروس‌ ها

سرم،CSF؛ سوآب از نازوفارنكس

موش ‌هاي شيرخوار،

كشت سلولي (ورو)

 

توضيح مربوط به بيماري ‌هاي

تب‌ دار را ببينيد.

انتروويروس‌ ها

مدفوع، سوآب از حلق، CSF

كشت سلولي (PMK، HEL

آزمون‌ هاي تقويت اسيد نوكلئيك

 

ويروس‌ هاري

بزاق، بيوپسي مغز، بيوپسي پوست (پوست پشت گردن)

موش ‌هاي شيرخوار،

IF مستقيم

IF مستقيم ارجح است، زيرا سرعت تشخيص براي درمان مؤثر اهميت دارد.

هرپس ويروس

CSF

PCR

 

مننژيت

 

انتروويروس

CSF

كشت سلولي (PMK، HEL

آزمون ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك ارجح ‌اند.

 

 

ويروس اوريون

 

CSF، سوآب از نازوفارنكس، ادرار

 

كشت سلولي (PMK)

ويروس به واسطه هِم ادزورپشن گلبول‌ هاي قرمز خوكچه هندي طي 7-4 روز شناسايي مي ‌شود. HAI و IF براي شناسايي ويروس در كشت به كار مي‌ روند؛ PCR در آزمايشگاه ‌هاي بهداشت عمومي در دسترس است.

مونونوكلئوز عفوني

 

 

اپستين - بار ويروس (EB)

 

 

خون، سوآب از نازوفارنكس

 

كشت سلول لنفوئيد، PCR؛

آزمون سرولوژيك

كشت ويروس EB به طور روتين در آزمايشگاه ‌هاي ويروس شناسي انجام نمي ‌شود؛ NAAT ها هم به طور كيفي و هم به طور كمي استفاده مي‌ شوند.

 

 

سايتومگالوويروس

 

 

خون، ادرار، سوآب از حلق

كشت سلولي (HFF

كشت شِل ويال،

شناسايي آنتي ژن،

PCR

لوله ‌هاي كشت بافت بايد 4 هفته نگه داشته شوند؛ شِل ويال 24 ساعت با رنگ‌ آميزي آنتي ژن توسط DFA؛

NAAT ها در دسترس ‌اند.

هپاتیت (فصل 37 را براي آزمون‌ هاي در دسترس ببينيد)

ويروس هپاتيت A

سرم، مدفوع

IEM، EIA، RT-PCR

 

ويروس هپاتيت B

سرم

EIA، PCR

 

ويروس هپاتيت C

سرم

EIA، PCR

 

ويروس هپاتيت D

سرم

EIA

 

انتريت

روتاويروس

مدفوع

EIA

 

عامل نوروالك،

كالسي ويروس ‌ها، آستروويروس ‌ها

مدفوع

IEM، EIA؛

NAAT ها در توسعه

 

اِگزانتِم‌ ها

واريسلا - زوستر ويروس

مايع وزيكول

كشت سلولي (HEK).

فلئورسنت آنتي بادي مستقيم

حساس ترین است.

CPE معمولاً در 4 روز تا 2 هفته نمايان مي‌ شود.

NAAT ها در دسترس ‌اند.

ويروس سرخك (روبِئولا)

سوآب از نازوفارنكس، خون، ادرار

كشت سلولي (PMK، HEK). فلئورسنت آنتي بادي مستقيم

CPE معمولاً در 3-2 هفته نمايان مي‌شود؛ سرولوژي

ويروس سرخجه (روبِلا)

سوآب از نازوفارنكس، خون، ادرار

كشت سلولي (AGMK، ورو)

سرولوژي

مانكي پاكس، كوپاكس، واكسينيا، و تاناپاكس ويروس‌ ها

مايع وزيكول

تخم‌ مرغ‌ هاي جنين‌ دار،

بررسي با ميكروسكوپ الكتروني

آزمون ‌ها تنها در آزمايشگاه‌ هاي بهداشت عمومي انجام مي‌ گيرند.

هرپس سيمپلكس ويروس

وزيكول‌ ها، معمولاً دهان يا دستگاه تناسلي

كشت سلولي (HFF، ورو)؛

PCR

کشت ها معمولاً در 72-24 ساعت مثبت می شوند؛ IF مستقیم سریع است؛ NAAT ها در دسترس اند.

پارووویروس

خون

سرولوژی، PCR

پاروتيت (التهاب غدد بناگوشي)

ويروس اوريون

سوآب از نازوفارنكس، ادرار

كشت سلولي (PMK)

توضيح مربوط به مننژيت را ببينيد؛ سرولوژي

نابهنجاري‌ هاي مادرزادي

سايتومگالوويروس

ادرار، سوآب از حلق

مونونوكلئوز عفوني را ببينيد

 

روبلا

سوآب از حلق، CSF، خون

اگزانتم ‌ها را ببينيد.

سرولوژي

كونژكتيويت (التهاب ملتحمه)

هرپس سيمپلكس

سوآب از ملتحمه، ‌اشك

اگزانتم‌ ها را ببينيد.

 

هرپس زوستر

 

 

 

آدنوويروس

 

بيماري‌ هاي تنفسي را ببينيد.

 

انتروويروس‌

 

 

 

ايدز (سندرم نقص ايمني اكتسابي)

 

 

ويروس نقص ايمني انسان

 

 

خون، به ويژه گلبول ‌هاي سفيد

 

كشت سلولي PBC بيمار

(در اكثر آزمايشگاه ‌هاي باليني انجام نمي ‌پذيرد.)

آنتي بادي توسط EIA، تأييد توسط وِسترن بلات. ويروس تقريباً همواره در PBC قابل شناسايي است، حتي هنگامي كه آنتي بادي ‌هاي سرم حضور دارند؛ RT-PCR

عفونت های پاپوواویروس

پاپوواویروس انسانی JC

مغز، ادرار، نمونه های بافت

کشت سلولی (HFFEM

 

پاپوواویروس BK

تقویت اسید نوکلئیک

 

 

پاپيلوماويروس‌ ها

 

بيوپسي‌ ها، زگيل‌ ها

 

DNA ، IF

هيبريديزاسيون DNA بر روي اسمير هاي Pap مايع انجام

مي‌ گيرد.

 

AGMK، كليه ميمون سبز آفريقايي (African green monkey kidneyBHK كليه هامستر نوزاد (baby hamster kidneyCF، تثبيت كمپلمان (complement fixationCPE، اثر آسيب سلولي (cytopathic effectCSF، مايع مغزي نخاعي (cerebrospinal fluidDFA، فلئورسنت آنتي بادي مستقيم؛ EIA، سنجش ايمني آنزيم (enzyme immunoassayFA، فلئورسنت آنتي بادي (fluorescent antibodyHAI مهار هِم اَدزورپشن (hemadsorption inhibitionHEK، كليه جنيني انسان (human embryonic kidneyHEL، ريه جنيني انسان (human embryonic lungHEP-2 سلول ‌هاي اپيتليال انساني نوع 2 (human epithelial type 2 cellsHFF، فيبروبلاست ‌هاي پوست ختنه‌گاه انسان (human foreskin fibroblastsHI، مهار هماگلوتيناسيون (hemagglutination inhibitionIME بررسي با ميكروسكوپ الكتروني ايميـون (immune electron microscopyLLC-MK2، رده سلول كليه ميـمون (monkey kidney cell lineMDCK، رده سلول كليـه سگ (dog kidney cell lineNAAT، آزمـون تقويت اسیـد نوكلئيك (nucleic acid amplificationPBC، سلول ‌هـاي خون محيـطي (preipheral blood cellsPCR، واكنش زنجيـره ‌اي پليمـراز (polymerase chain reactionPMK، كليه اوليـه ميـمون (primary monkey kindlyRIA، راديـو ايمونواسي (radioimmunoassayRT-PCR، واكنش زنجيره ای پليمراز - ترانسكريپتاز معكوس (reverse transcriptase - polymerase chain reaction)؛ وِرو [Vero]، رده سلول كليـه ميـمون (monkey kidney cell line).

 

 

بررسي مستقيم مواد باليني : ميكروسكوپ و رنگ ‌آميزي

 

بيماري ‌هاي ويروسي‌ اي كه در آنها بررسي ميكروسكوپي مستقيم اسمير ها سودمند است، عبارتند از : هاري و عفونت هرپس سيمپلكس و عفونت‌ هاي پوستي واريسلا - زوستر. رنگ ‌آميزي آنتي ژن ‌هاي ويروسي با ايمونو فلئورسنس در اسمير هاي مغز و نمونه ‌هاي قرينه از حيوانات هار و از پوست پشت گردن انسان ‌ها شيوه ‌اي انتخابي براي تشخيص روتين هاري است.

 

كشت ويروس

الف) آماده سازي تلقيح

مواد مايع عاري از باكتري، نظير مايع مغزي نخاعي، خون كامل، پلاسما، يا لايه بافي كُت گلبـول سفيد ممكن است مستقيماً يا پس از رقيـق ‌سازي با محلول فسفات بافري (6/7 = pH) در كشت‌ هاي سلولي تلقيح گردند. تلقيح به تخم‌ مرغ‌ هاي جنين دار يا حيوانات براي جدا سازي ويروس، معمولاً تنها در آزمايشگاه‌ هاي تخصصي انجام مي ‌پذيرد.

    بافت در محيط ‌ها يا آب استريل شسته شده، با قيچي به قطعات كوچك برش داده مي ‌شود، و به منظور ساخت يك خمير همگن، خرد مي‌گردد. براي ايجاد غلظت 20-10 درصد (حجم / وزن)، رقيق كننده به مقدار كافي افزوده مي‌شود. اين سوسپانسيون را مي‌توان براي ضايعات سلولي نامحلول - رسوب در سرعت پايين (كمتر از rpm 2000) به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ كرد. مايع رويي را مي ‌توان تلقيح نمود؛ چنانچه باكتري ‌ها حضور داشته باشند، همچنان كه در زير بحث شده است، زدوده مي ‌شوند.

    بافت‌ هـا ممكن است همچنين با تريپسين مجـاور گردند و سوپانسيـون سلولی حاصله ممكن است (1) روي يك مونولاير سلولي كشت بافتِ موجود تلقيح شود يا (2) همزمان با سوسپانسيون سلولي ديگري از سلول ‌هايی که مشخص شده است عاري از ويروس اند، كشت شود.

    چنانچه مواد مورد آزمون حاوي باكتري‌ها باشند (مايع حاصل از شستشوي حلق، مدفوع، ادرار، بافت آلوده، يا حشرات)، آنها بايد پيش از تلقيح، غير فعال يا حذف شوند.

 

1. عوامل باكتري سیدال آنتي بيوتيك ‌ها معمولاً در تركيب با سانتريفيوژ افتراقي به كار مي‌ روند (ادامه را ببينيد).

 

2. شيوه‌ هاي مكانيكي

a. صافي ‌ها صافي (فيلتر) هاي غشايي نوع ميلي پور از استات سلولز يا مواد مشابه ترجيح داده مي ‌شوند.

 

b. سانتريفيوژ افتراقي اين يك روش بسيار مناسب براي حذف باكتري‌ها از نمونه‌هاي بسيار آلوده ويروس‌هاي كوچك است. باكتري‌ها در سرعت هاي پاييني رسوب مي ‌شوند كه ويروس را رسوب نمي ‌دهد و سانتريفيوژ با سرعت بالا ويروس را رسوب مي‌ دهـد. سپس، رسوب حـاوي ويروس در يك حجم كوچك دوباره سوسپانسيون مي‌شود.

 

ب) كشت در كشت سلولي

تكنيك‌ هاي كشت سلولي جاي خود را به شيوه ‌هاي شناسايي آنتي ژن و NAAT ها می دهند. با اين حال، آنها هنوز سودمند بوده و در آزمايشگاه‌هاي باليني، تحقيقاتي، و ويروس شناسي بهداشت عمومي انجام مي‌شوند. هنگامي كه ويروس‌ ها در كشت سلولي تكثير گردند، اثـرات بيولوژيك (براي مثال، تغييرات سايتوپاتويك، تداخل ويروسي، توليد هماگلوتينين) به وجود مي ‌آيند كه اجازه شناسايي عامل را مي‌ دهند.

    كشت ‌هاي لوله آزمايش با افزودن سلول‌ هاي سوسپانسيون شده در 2-1 میلی لیتر از مايع نوترئينت حاوي محلول‌هاي نمك و انواع فاكتور هاي رشد (معمولاً سرم، گلوكز، اسيد هاي آمينه، و ويتامين ‌ها) آماده مي ‌شوند. سلول‌ها با ماهيت فيبروبلاستيك يا اپيتليال به جدار لوله آزمايش اتصال يافته، بر روي آن رشد مي ‌كنند، ‌و در آنجا ممكن است به كمك يك ميكروسكوپ با قدرت پايين بررسي شوند.

    با بسياري از ويروس ‌ها، رشد عامل با تحليل اين سلول‌ ها موازي است (شكل 1-47). برخي از ويـروس‌ هـا در كشت سلولي يك اثـر سايتوپـاتيك (CPE) مشخـص (منقبض شدن، تـورم، گرد شدن سلول‌ هـا، تشكيـل سينسيتيوم ‌ها، يا خوشه‌ ها) ‌را ايجاد كرده، ‌هنگامي كه سندرم باليني مشخص است تشخيص احتمالي سريع را ممكن مي ‌سازند. براي مثال، ويروس سين سیشيال تنفسي به طور مشخص سلول‌ هاي غول آساي چند هسته‌ اي (سينسيتيوم‌ ها) را توليد مي‌ نمايد، در حالي كه آدنوويروس ‌ها خوشه‌ هاي انگور مانندي از سلول ‌هاي گرد را به وجود مي آورند. بعضي از ويروس‌ ها (مانند ويروس سرخجه) تغييرات سايتوپاتيك مستقيمي را ايجاد نمي ‌كنند، اما مي ‌توان آنها را به واسطه تداخل ‌شان با CPE يك ويروس دوم شناسايي كرد (تداخل ويروسي). ويروس‌ هاي آنفولانزا و برخي از پارا ميكسوويروس‌ها، چنانچه گلبول‌ هاي قرمز به كشت‌ هاي آلوده اضافه شوند، ممكن است ظرف 48-24 ساعت مورد شناسايي قرار گيرند. ويروس‌ هايي كه در غشاي سلولي در حال بلوغ ‌اند، يك هماگلوتينين را توليد مي ‌كنند كه گلبول‌ هاي قرمز را قادر به جذب در سطح سلول مي ‌سازد (هِم اَدزورپشن). هويت يك جدا شده از ويروس با آنتي سرم اختصاصي به نوع نشان داده مي‌شود، كه رشد ويروس را بازداشته يا با آنتي ژن‌ هاي ويروسي واكنش مي ‌دهد.

    بعضي از ويروس‌ ها را مي ‌توان در كشت رشد داد، اما اين روند بسيار آهسته و دشوار است. براي تشخيص چنين عفونت‌ هايي، به جاي كشت، از آزمون ‌هاي جايگزين استفاده مي ‌شود (ادامه را ببينيد).

 

پ) كشت ‌هاي شِل ويال (كشت پيشرفته با سانتريفيوژ)

اين شيوه اجازه شناسايي سريع ويروس ‌ها را در نمونه‌ هاي باليني مي ‌دهد. اين روش براي چند ويروس، از جمله سايتومگالوويروس و واريسلا - زوستر ويروس، سازگار مي ‌باشد. براي مثال، سایتومگالوويروس (CMV) را مي‌ توان در مقايسه با 4-2 هفته براي كشت سلولي كلاسيك، ظرف 24-12 ساعت شناسايي نمود، حساسيت شِل ويال و كشت سلولي كلاسيك براي CMV قابل مقايسه است. مونولاير ها از رده سلولي مناسب (مانند سلول ‌هاي MRC-5  براي CMV) بر روي لامل ‌ها در شِل ويال‌ هاي 45×15 ميلي متري dram -1 رشد مي ‌كنند. پس از تلقيح با نمونه، ويال ‌ها به مدت 40 دقيقه در دماي اتاق در g × 700 سانتريفيوژ مي‌ گردند. ويال ‌ها در دماي C°37 به مدت 24-14 ساعت انكوبه شده، ثابت مي‌شوند و با آنتي بادي‌هاي مونوكلونال اختصاصي براي پروتئين هسته ‌اي CMV كه در اوايل كشت حضور دارد، واكنش مي ‌دهند؛ چنين آنتي بادي ‌هايي به طور تجاري در دسترس هستند. شيوه ‌هاي رنگ ‌آميزي مستقيم يا غير مستقيم آنتي بادي و بررسي با ميكروسكوپ فلئورسنس براي تعيين كشت ‌هاي مثبت شل ويال به كار مي ‌روند. ويال‌هاي كنترل مثبت و كنترل منفي در هر دور آزمون گنجانده مي ‌شوند. با توسعه يك تغيير در تكنيك شل ويال اجازه برداشت و شناسايي همزمان چند ويروس تنفسي با استفاده از سلول ‌هاي R-Mix داده شده است. اين از طريق شركت تجـاري Quidel/Diagnostic Hybrids در دسترس است. يك ويال حـاوي (مخلوط) دو رده سلولي نظيـر كارسينوم A549 ی ريـه انسان و سلول هاي Mv1Lu ی فيبروبلاست ريه سمور (منيك) مي ‌باشد. آزمايشگـاه معمولاً دو عدد از اين نوع ويال‌ هـا را تلقيح مي ‌كند. 24-18 ساعت بعد از تلقيح، يك ويال با استفاده از شناساگر آنتي بادي ايمونوفلئورسنتِ "آمیخته" كه تمام ويروس‌ هاي تنفسي را مي ‌شناسد، رنگ ‌آميزي مي‌ شود. چنانچه رنگ ‌آميزي مثبت باشد، آنگاه سلول ‌هاي روي لامل ويال دوم خراشيده شده، در يك لام هشت چاهك دار تلقيح مي ‌شوند و سپس با شناساگر ‌هاي مونوكلونال تكي كه ويـروس اختصاصي را شناسايي مي ‌كنند، رنگ ‌آميـزي مي ‌گردند. جدا شده ‌هـا به كمك تكنيك شل ويال به دست نمي ‌آيند. چنانچه براي آزمون حساسيت به دارو هاي ضد ويروسي، جدا شده ‌ها لازم باشند، بايد از تكنيك كلاسيك كشت سلولي بهره گرفت.

 

اصول ميكروب ‌شناسي پزشكي - EIA - تشخيص اتيولوژيك (علت شناسی) عفونت - لاتكس آلگوتيناسيون - ‌آنزيم ايمونواسي - رنگ ‌آميزي آنتي باديِ نشان دار شده با فلئورسئين - ارتباط ميان پزشك و آزمايشگاه - تشخيص عفونت ‌هاي باكتريايي و قارچي - بررسي با ميكروسكوپ و رنگ ‌آميزي ‌ها - ميكروبيولوژي تشخيصي - NAAT - تكنيك ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك - nucleic acid amplification techniques - كالكوفلئور وايت - PAS - متنامين سيلور اسيد - شيف دوره‌اي - periodic acid-Schiff - رنگ ‌آميزي شده با نقره (سيلور) - سيستم ‌هاي كشت - مك كانكي آگار يا ائوزين - متيلن بلو [EMB] آگار - محيط‌ هاي بوردِت - ژانگو - محيط‌ حاوي چاركول (زغال چوب) - سوبسترا هاي كروموژنيك (رنگ زا) - آزمون ‌هـاي IF - زمون ‌هـاي فلئورسنت آنتي بادي مستقيم و غير مستقيم - EIA ها - سنجش‌هاي جاذب ايمني مرتبط با آنزيم (ELISA) - آزمون‌ هـاي آگلوتيناسيون واكنش كالريمتريك (رنگ سنجي) - آزمون آنتي ژن ادراري Binax NOW براي استرپتوكوكوس پنومونيه - پلي كلونال يا مونوكلونال - پروتئين A (سويه كوان I) - ايمونواسي های وسترن بلات - پروب DNA شركت Gen-Probe - هيبريديزاسيون در محل in situ- Woburn،MA - هيبريديزاسيون در محل اسيد نوكلئيك پپتيد - فلئورسنس يا PNA - پروتكل ‌هاي PCR رئال تايم - - AdvanDx - شناسايي باكتري ‌ها با استفاده از rRNA ی S16 - تِروفريما ويپِلِئي - عامل بيماري ويپِل - - FISH - سيستم ‌هاي تقويت هدف - peptide nucleic acid–fluorescence in situ hybridization - واكنش زنجيره‌ اي پليمراز (PCR) - دناچوره شدن - denaturation - آنيلينگ يا هيبريد شدن - annealing - بسط پرايمر - primer extention - PCR ترانسكريپتاز معكوس - reverse transcriptase PCR - آنزيم ترانسكريپتاز (نسخه بردار) معكوس - LCR - رونويسي RNA به DNA - عفونت بوردتلا پرتوسيس (سياه سرفه) - سيستم ‌هاي تقويت پروب - واكنش زنجيره ‌اي ليگاز - ligase chain reaction - شكاف (gap) - تكنيك‌ هاي تقويت سيگنال - TMA - آنزيم‌ هاي فلئورسنس - branched DNA - سيستم DNA منشعب - bDNA - سيستم ‌هـاي تقويت با واسطه رونويسي - transcription-mediated amplification - تقويت مبتني بر تولید اسيـد نوكلئيك‌ - NASBA - nucleic acid sequence-based amplification - سنجش ‌هاي ايزوتِرمال (هم دما) - آنزيم ‌هاي ترانسكريپتاز معكوس، RNase H - سنجش‌ هاي جا به‌ جايي رشته - SDA - strand displacement assays - سنجش‌ هاي تقويت ايزوترمال‌ - اندوكلئاز تحديدي - تقويت ايزوترمال با واسطه حلقه - LAMP - تقويت رئال تايم - PCR رئال تايم ترموسايكلِر هاي (چرخش دهنده‌ هاي حرارتي) - ملكول ‌هاي فلئوروژنيك - fluorogenic - سبز SYBR - روش‌ هـاي شناسايي اختصاصي آمپليكون - MS - محصول PCR - TaqMan پروب ‌هاي هيدروليز - FRET - پروب ‌هاي انتقال انرژي فلئورسنس - fluorescence energy transfer - نشان‌ هاي ملكولي molecular beacons - طيف سنجي جرمی - mass spectrometry - طيف سنجي جرمي يونيزاسيون / دفع ليزري به كمك ماتريكس با زمان پرواز MALDI-TOF MS - matrix –assisted desorption ionization time-of flight mass spectroscopy - PCR برچسب جرمي (MassTag PCR) - برچسب (tag) - طيف سنجي جرمي يونيزاسيون الكترواِسپري PCR - PCR-ESI-MS (PCR electrospray ionization mass spectroscopy) از يك نرم افزار آیبيس پِلَت فُرم (Ibis platform) - MALDI بيوتايپر (MALDI Biotyper) - شيمادزو (Shimadzu) - سرعت‌ هاي متفاوت "پرواز - زمان پرواز [time of flight]) - اهميت ميكروبيوتاي نرمال باكتريایی و قارچي - آزمون حساسيت انتشار ديسك - disc diffusion susceptibility test - پني‌ سيلين ‌هاي آنتي پسودومونايي - مؤسسه استانداردهاي باليني و آزمايشگاهي - CLSI - clinical and laboratory standards Institute - آزمون نيمه كمّي حداقل غلظت‌ مهاري - minimum inhibitory concentration - MIC - حـداقل غلظت باكتري سيدالي يا MBC - minimum bactericidal concentration - تشخيص عفونت بر اساس جايگاه آناتوميك - تكنيك ‌هاي آسپتيك آسپيره (مكش) - نمونه آنتي گوآگوله (ضد لخته) - مطالعه سيتولوژيك (سلول‌ شناسي) - ماهيت نئوپلاستيك (بدخيمي) - پروتئينوري - حضور پروتئين در ادرار - - باكتری يوري - حضور باكتري در ادرار- پيوري - حضور چرك در ادرار - كشت ادرار - سندرم پيشابراه - انسداد پيشابراه - سل مثانه - مايع مغزي نخاعي - ترشحات تنفسي - اندوسِرويسيـت - سوزش غشـاي مخاطي در گردن رحم - سوزاك - عفونت ‌هاي تناسلي كلاميديايي - هرپس (تبخال) تناسلي - سفليس - آزمون فلوكولاسيون مثبت - سنجش‌ هاي شميلومينسنس - شانكروئيد گرانولوم كشاله ران - واژينوز / واژينيت - عفونت ‌هاي بي ‌هوازي - عفونت‌هاي پيرامون دندان -آبسه‌هاي پيرامون دهان - سينوزيت و ماستوئيديت - التهاب زائده پستاني - سيستم عصبي مركزي - عفونت ‌هاي درون شكمي و لگن - عفونت ‌هاي پوست و بافت نرم - تشخيص عفونت ‌هاي كلاميديايي - كولدوسنتزيس يـا مكش از لوله رحم - culdocentesis - CF - آزمون تثبيت كمپلمان - complement fixation - كليه ميمون سبز آفريقايي - African green monkey kidney - كليه هامستر نوزاد - baby hamster kidney - تثبيت كمپلمان - - اثر آسيب سلولي - cerebrospinal fluid - cytopathic effect - سنجش ايمني آنزيم - enzyme immunoassay - فلئورسنت آنتي بادي - fluorescent antibody - مهار هِم اَدزورپشن - hemadsorption inhibition كليه جنيني انسان - - human embryonic kidney - ريه جنيني انسان - human embryonic - HEP-2 - - سلول ‌هاي اپيتليال انساني نوع 2 human epithelial type 2 cells - فيبروبلاست ‌هاي پوست ختنه‌گاه انسان - human foreskin fibroblasts - مهار هماگلوتيناسيون - hemagglutination inhibition - بررسي با ميكروسكوپ الكتروني ايميـون - - immune electron microscopy LLC-MK2 - رده سلول كليه ميمون - monkey kidney cell line رده سلول كليه سگ - dog kidney cell line - آزمون تقويت اسید نوكلئيك - nucleic acid amplification - سلول ‌هاي خون محيطي - preipheral blood cells كليه اوليـه ميمون - primary monkey kindly وِرو - Vero - رده سلول كليه ميـمون - monkey kidney cell line - آماده سازي تلقيح - Enzyme-Linked Virus-Inducible System - كشت ‌هاي شِل ويال (كشت پيشرفته با سانتريفيوژ) - طريق شركت تجـاري Quidel/Diagnostic Hybrids - سيستم القا پذیر با ويروس - ميكروسكوپ الكتروني ايميون - immune electran microscope - آزمون‌ هاي پيش آگهي و نظارت بر درمان

شكل 1-47. A : مونولاير سلول هاي رنگ ‌آميزي نشده‌ ي طبيعي كليه ميمون در كشت (×120). B : كشت سلولی رنگ ‌آميزي نشده كليه ميمون مرحله اوليه از اثرات سايتوپاتيك شاخص براي عفونت انتروویروس را نشان مي‌ دهـد (×120). تقريبـاً 25% از سلول ‌هـا در كشت اثـرات سايتوپاتيكِ حاكي از تكثير ويروسي را نشان مي ‌دهند (اثرات سايتوپاتيك +1). C : كشت سلولی رنگ‌ آميزي نشده‌ ي كليه ميمون اثرات سايتوپاتيك انتروويروسي پيشرفته تر را نشان مي‌ دهد (اثرات سايتوپاتيك +3 تا +4) (×120). تقريباً 100% از سلول‌ ها تحت تأثير قرار گرفته ‌اند و بخش زيادي از صفحه سلولي از جدار لوله كشت شُل شده است.

 

سيستم القا پذیر با ويروس، مرتبط با آنزيم (ELVIS)

[Enzyme-Linked Virus-Inducible System]

اين رده سلولي اختصاصي (Quidel/Diagnostic Hybrids) سيستم جديدي است كه براي شناسايي ويروس ‌هاي هرپس سيمپلكس (HSV) در كشت كاربرد دارد. رده سلول كليه‌ هامستر نوزاد با استفاده از توالي پروموتر ژن UL97 از HSV و ژن LacZ از اشريشياكولي به طور ژنتيكي مهندسي شده است. هنگامي كه هرپس ويروس‌ ها در نمونه‌ هاي باليني حضور داشته باشند، آنها پروموتر UL97 را فعال ساخته، كه ژن lacZ را براي توليد آنزيم β- گالاكتوزيداز فعال مي ‌كند. زماني كه يك سوبسترا براي اين آنزيم افزوده شود، رنگ آبي توليد مي‌گردد، كه بيانگر حضور ويروس است. تايپينگ (تعيين نوع) HSV را مي ‌توان بر روي كشت‌ هاي مثبت، براي مثال با افزودن آنتي بادي ‌هاي مونوكلونال كه HSV-2 را مي ‌شناسند، انجام داد.

 

شناسايي آنتي ژن

شنـاسايي آنتي ژن ‌هـاي ويروسي بـه طور گستـرده در ويـروس شناسي تشخيصي استفاده مي ‌شود. براي شناسايي بسياري از ويروس ها، از جمله هرپس سيمپلكس I و II، آنفولانزاي A و B، ويروس سين سيشيال تنفسي، آدنوويروس‌ ها، ويروس‌ هاي پارا آنفولانزا، روتاويروس، و سايتومگالوويروس كيت‌ هاي تجاري در دسترس هستند. به علاوه، انـواع متعددي از سنجش ‌ها مورد استفاده قرار مي ‌گيرند : EIA، فلئورسنت آنتي بادي مستقيم، فلئورسنت آنتي بادي غير مستقيم، آگلوتيناسيون لاتكس و غيره. مزاياي استفاده از اين روش ‌ها اين است كه آنها اجازه شناسايي ويروس‌ هايي را مي‌ دهند كه در كشت سلولي به سرعت رشد نمي‌ كنند (مانند روتاروويروس ‌ها، ويروس هپاتيت A) يا رشد بسيار آهسته ‌اي دارند (مانند سايتومگالوويروس). به طور كلي، سنجش ‌هاي شناسايي آنتي ژن براي ويروس ‌ها نسبت به شيوه‌ هاي كشت ويروسي و NAAT ها از حساسيت كمتري برخوردار اند. همچنان كه پيشتر ذكر گرديد، بسياري از اين سنجش‌ ها جاي خود را به تكنيك ‌هاي ملكولي داده و يا خواهند داد.

 

تقويت و شناسايي اسيد نوكلئيك

براي شناسايي اسيد نوكلئيك ويروسي يا تقويت و شناسايي آن، طيف گسترده‌اي از سنجش ‌هاي تجاري در دسترس مي ‌باشند. اين روش‌ ها به سرعت در حال تبديل شدن به استانداردهايي براي ويروس شناسي تشخيصي بـوده، جـاي كشت سنتي ويروس و تكنيك ‌هـاي شناسايي آنتي ژن را مي ‌گيرند. اين روش ‌ها عبارتند از : PCR، RT-PCR، و ساير شيوه ‌هاي اختصاصي. اين روش ‌ها اجازه شناسايي ويروس ‌ها (مانند انتروويروس‌ ها و بسياري ديگـر)، به علاوه اجازه سنجش كمّي ويروس‌ هـا (مانند سايتو مگالوويروس، اپستين - بار ويروس، ويروس‌ هاي هپاتيت B و C، و HIV) را مي‌ دهند. داده‌ هاي به دست آمده از سنجش‌ هاي كمّي براي هدايت درمـان در بيماري‌ هاي ويروسي متعدد استفاده مي ‌شوند. يك مثال خوب HIV/ايدز است.

 

هيبريديزاسيون اسيد نوكلئيك

هيبريديزاسيون اسيد نوكلئيك براي شناسايي ويروس ‌ها بسيار حساس و اختصاصي است. نمونه به صورت نقطه (لكه) بر روي يك غشاي نيترو سلولزي گذاشته مي ‌شود، و اسيد نوكلئيك حاضر در نمونه متصل مي ‌گردد؛ سپس، اسيد نوكلئيك با قليا ها در محل دناچوره شده و با يك قطعه اسيد نوكلئيك نشان دار هيبريد مي‌ شود، و محصولات هيبريد شده مورد شناسايي قـرار مي ‌گيـرند. براي روتاويـروس كه واجد RNA ی دو رشتـه‌اي است، شيوه هيبريديزاسيون نقطه حتي از EIA نيز حساس ‌تر مي ‌باشد. RNA در نمونه ‌هاي مدفوعي روتاويروس دارِ دناچوره شده با حرارت، همان طور كه در بالا گفته شد، بي‌ حـركت مي‌ شود و بـا پروب ‌هـاي تك رشته‌ ايِ نشان دارِ به دست آمده به واسطه رونويسي روتاويروس در شرايط آزمايشگاهي،‌ هيبريديزاسيون در محل انجام مي ‌پذيرد.

 

اندازه ‌گيري پاسخ ايمني نسبت به عفونت ويروسي

به طور معمول، يك عفونت ويروسي پاسخ‌ هاي ايمني را عليه يك يا چند آنتي ژن ويروسي فرا مي‌ خواند. معمولاً پاسخ‌ هاي ايمني سلولار و هومورال، هر دو، توسعه مي ‌يابنـد، و اندازه ‌گيـري هر يك ممكن است در تشخيص عفونت‌ هـاي ويروسي استفاده شود. ايمني سلولي ممكن است با ازدياد حساسيت پوستي، تغيير لنفوسيت، و آزمون ‌هاي سميت سلولي ارزيابي گردد. پاسخ ‌هاي ايمني هومورال اهميت تشخيصي اصلي دارند. آنتي بادي ‌ها از كلاس IgM در ابتدا ظاهر گشته و به دنبال آنها آنتي ‌بادي‌هاي IgG نمايان مي ‌شوند. آنتي ‌بادي‌ هاي IgM طي چند هفته ناپديد مي‌ گردند، در حالي كه آنتي ‌بادي ‌هاي IgG سال‌ هاي زيادي باقي مي‌ مانند. تشخيص يك عفونت ويروسي به طور سرولوژيك با نشان دادن افزايش در تيتر آنتي بادي عليه ويـروس يـا با اثبات آنتي بادي‌ هـاي ضد ويروسي از كلاس IgM انجـام مي ‌شود (فصل 8 را ببينيد). شيوه‌ هـاي مورد استفاده عبـارتند از : آزمـون خنثي سازي يا Nt (neutralization)، آزمـون تثبيت كمپلمان يا CF (complement fixation) آزمـون مهـار هماگلوتيناسيـون يا HI (hemagglutination inhibition)، آزمـون ايمونو فلئورسنس يا IF (immunofluorescence)، آزمون همگلوتيناسيون غير فعال يا PHA (passive hemagglutionation)، و آزمـون ايمونو ديفيوژن يا ID (immunodiffusion).

    اندازه‌ گيري آنتي ‌بادي‌ها با شيوه‌ هاي مختلف لزوماً نتايج موازي نمي‌دهد. آنتي ‌بادي‌ هاي شناسايي شده توسط آزمـون CF در جريـان يك عفونت انتـروويروسي و در دوره نقاهت حضور دارنـد، اما آنها پايـدار نيستند. آنتي بادي ‌هاي شناسايي شده توسط آزمون Nt در جريان عفونت نمايان مي ‌شوند و سال ‌ها باقي مي ‌مانند. ارزيابي آنتي ‌بادي‌ ها با روش ‌هاي مختلف در افراد يا گـروه‌ هايي از افراد، اطلاعات تشخيصي و همچنين اطلاعاتی در مـورد جنبه ‌هاي اپيدميولوژيك بيماري را فراهم مي ‌كند.

    هنگامي كه ويروس پيش از نمايان شدن تظاهرات باليني، دوره كمون طولاني دارد، براي تشخيص ويروسي، آزمون‌ هـاي سرولوژيك مفيد ترين آزمون‌ها هستند. فهرست مختصري از چنين ويروس‌هايي عبارتند از : اپستين - بار ويروس، ويروس‌ هاي هپاتيت،‌ ويروس نيل غربي، و HIV. معمولاً آزمون براي آنتي ‌بادي ‌هاي ضد اين ويروس‌ ها نخستين گام در تشخيص است و پس از آن ممكن است، در اكثر موارد، براي ارزيابي سطوح ويروسِ در گردش، به عنوان برآوردي از عفونت و يا پاسخ به درمان ‌هاي ضد ويروسيِ اختصاصي، از تقويت اسيد نوكلئيك استفاده شود. ديگـر سودمنـدي مهم آزمون ‌هاي سرولوژيك، ارزيابي آسيب ‌پذيري فرد به يك ويروس يا مواجهه قبلي با آن و احتمال فعال شدن مجدد به هنگام سركوب ايمني يا پيوند عضو است.

 

بررسي با ميكروسكوپ الكتروني ايميون

ويروس‌ هايي كه با تكنيك ‌هاي معمول قابل شناسايي نيستند، ممكن است به كمك ميكروسكوپ الكتروني ايميون يا IEM (immune electran microscope) مشاهده شوند. كمپلكس ‌هـاي آنتي‌ژن - آنتي بادي یا تجمعات شكل گرفته بين ذرات ويروس در سوسپانسيون، از حضور آنتي ‌بادي ‌ها در آنتي سرم افزوده شده ناشي مي ‌شوند و از ذرات منفرد ويروس آسان‌ تر و با اطمينان‌ بيشتري مـورد شناسايي قرار مي ‌گيـرند. IEM براي يافتن ويروس‌ هاي مسبب انتريت و اسهال به كار مي ‌رود؛ اين ويروس‌ها را معمولاً نمي ‌تـوان به طور روتيـن كشت داد. روتاويـروس تـوسط EIA شناسايـي مي ‌شود.

 

HIV

HIV-1 در سرتاسر جهان وجود دارد، در حالي كه HIV-2 ي كمتر پاتوژن عمدتاً در غرب آفريقا و چند ناحيه جغرافيايي ديگر ديده مي شود. عفونت HIV يك مـورد خاص را در ويروس شناسي تشخيصي ارائـه مي‌ دهد. تشخيص آزمايشگـاهي بايد، با اندك نتيجـه مثبت كـاذب يا بدون احتمال يك نتيجـه مثبت كاذب، دقيقاً به دست آيـد. پس از رسيدن به تشخـيص، آزمون ‌هاي آزمايشگاهي به منظور پيگيري پيشرفت عفونت و كمك به بررسي اثربخشي درمان استفاده مي ‌شوند. بانك‌ هاي خون براي شناسايي هر دو ويروس در خون ‌هاي اهدايي و، در نتيجه، جلوگيري از عفونت HIV مرتبط با تزريق خون، از آزمون‌ هاي بسيار حساس استفاده مي ‌كنند.

    درك آزمون ‌هاي تشخيصي براي HIV و آزمون‌ هاي مورد استفاده براي بررسي عفونت نيازمند درك ساختار HIV و همانند سازي آن، به علاوه پاسخ ايمني نسبت به عفونت، مي‌ باشد. خلاصه ‌اي از اين مباحث در اينجا ارائه شده است. HIV در فصل 44 با جزئيات بيشتر بحث گرديده است.

    HIV-1 و HIV-2 رتروويروس ‌اند. آنها پوشش داشته و از رشته منفردي از RNA ی پلاريته مثبت برخوردار مي ‌باشند. RNA با استفاده از آنزيم‌ ويروسي ترانسكريپتاز معكوس بهDNA  رونويسي مي‌ شود و DNA درون ژنوم سلول ميزبان الحاق مي ‌گردد. پروتئين ويروسي ‌اي كه اغلب مورد سنجش قرار مي ‌گيرد، p24 (پروتئين كپسيد) است. پاسخ‌ هاي آنتي بادي را مي ‌توان عليه انواعي از محصولات ژن HIV-1 يافت : محصولات env، گليكوپروتئين (gp) 160 (gp160، gp120، gp41gag، p24، p17، p9، p7؛ و pol، p66، p51، و p32. ويـروس HIV-2 محصولات ژني مشابه دارد.

    دو تا 6 هفته پس از عفونت، 50% از بيماران يا بيشتر به سندرم شبه مونوكلئوز عفوني دچار مي‌ شوند. در اين زمان، سطوح بالايي از HIV-1 در خون وجود دارد، كه مي ‌تواند به واسطه كشت يا PCR ترانسكريپتاز معكوس پي برده شود. آنتي‌بادي‌هاي ضد پروتئين‌هاي HIV-1 دو تا هشت هفته پس از عفونت قابل شناسايي مي‌گردند. عليه محصولات ژن gag پاسخ IgM وجود دارد، كه به تدريج به پاسخ IgG تغيير مي ‌يابد. به طور كلي، پاسخ ‌هاي IgG برضد P24 و gp120 در ابتدا رخ مي‌ دهند و به دنبال آن پاسخ ‌ها بر ضد P41 و ساير پروتئين ‌ها اتفاق مي ‌افتند. با پاسخ‌ آنتي بادي، سطوح ويـرمي و p24 پايين آمده و ممكن است در طول دوره نهفتـه عفونت، غير قابل شناسايي شوند، در حالي كه سطح آنتي بادي ضد p24 بالا باقي مي ‌مانند. در اواخـر دوره بيماري، سطوح آنتي بادي ضد p24 كاسته شده، در حالي كـه آنتي ژن p24 افزايش پيدا مي‌ كند. در اوايـل زمان پس از عفونت، هنگامي كه سطوح بالايي از ويرمي HIV-1 وجود دارد، شمار سلول  T ی CD4 كاهش مي ‌يابد. در اوايل دوره نهفته، شمار سلولي T ي CD4 به سمت طبيعي بر مي‌گردد و طي زمان تنها به طور تدريجي و در مراحل پاياني ايدز با سرعت بيشتري كاهش پيدا مي ‌نمايد.

    آزمون ‌هاي مورد استفاده براي تشخيص HIV-1، محصولاتی به طور تجاري در دسترس ‌اند كه بسيار توسعه يافته و استاندارد شده هستند. براي يك نوع آزمون ممكن است چند كيت در دسترس باشد. اين آزمون ‌ها در زير خلاصه گرديده‌ اند.

 

سنجش‌ ها براي آنتي ‌بادي ‌هاي آنتي HIV

الف) سنجش ايمني مرتبط با آنزيم (آنزيم ايمونواسي)

ELISA (يا EIA) آزمون غربالگري اصلي براي تشخيص عفونت HIV-1 است. بـه طور كلي، آنتي‌ ژن ‌هـاي HIV-1 بـر روي يك سطح جـامد، معمولاً چاهك‌ ها  يا دانه ‌هاي پلاستيكي، بي ‌حركت مي ‌گردند. سرم بيمار و شناساگر هاي مناسب افزوده مي‌ شوند. آنتي‌ بادي‌ هاي ضد HIV-1 به آنتي ژن‌ هاي HIV-1 اتصال مي‌ يابند و آنگاه با IgG ی آنتي هيومَن (ضد انساني) نشان ‌دار شده با آنزيم و يك واكنش كالِريمِتريك (رنگ سنجي) پي برده مي ‌شوند. با غلظت ‌هاي بالاتر آنتي بادي ضد HIV-1 به تناسب مقدار رنگ بيشتر است. رنگ بالاتر از يك نقطه برش (cutoff point) خاص، يك آزمـون مثبت در نظـر گرفته مي ‌شود. ELISA (الايـزا) براي HIV-1 بيش از 99% حساس و 99% اختصاصي است. نوزادان متولد شده از مادران مبتلا بهHIV-1 ، به دليل انتقال آنتي بادي‌ها از راه جفت، عموماً براي HIV-1، الايزا - مثبت هستند. چنانچه نوزاد واقعاً به HIV-1 آلوده نشده باشد، اين آزمون به تدريج منفي خواهد شد. چند نسل از اين آزمون‌ ها تكامل يافته ‌اند، بسياري از آنها خودكار (اتوماتيك) مي‌ باشند و تقريباً تمام روش ‌هاي موجود اجازه شناسايي همزمان HIV-1 و HIV-2 را مي‌ دهند.

    لزوم شناسايي سريع افرادي كه ممكن است HIV مثبت باشند. و انجام اين كار در حالي كه آنها هنوز در محيط درمانگاه هستند، به بهبود هايي در آزمون EIA منجر گرديده است. يك سنجش براي آزمايش ترشحات دهاني توسعه پيدا كرده است. علاوه بر اين، چند ايمونواسي سريع براي استفاده با خون كامل، پلاسما، و سرم نيز به تأييد رسيده ‌اند. با تمامي آزمون ‌هاي سريع بايد به همان طريقِ سنجش‌هاي معمول رفتار شود. نتايج مثبت بايد با وسترن بلات تأييد گردند، و شخصي كه منفي است اما شك باليني قوي ‌اي براي وي وجود دارد، بايد يك آزمون تكراري براي او انجام گيرد يا در صورت در دسترس بودن NAAT، با آن مورد آزمايش واقع شود.

 

ب) وسترن بلات

آزمون وِستِرن بلات به عنوان سنجشي از آنتي ‌بادي‌ هاي اختصاصي ضد HIV-1 براي تأييد نتيجه ی مثبت الايزا استفاده مي ‌شود. در وسترن بلات، پروتئين ‌هاي HIV-1 بر روي يك نوار نيترو سلولزي به طور الكتروفورتیک از هم جدا مي‌ شوند. نوار با سرم بيمار انكوبه مي‌ شود. متعاقباً، آنتي بادي‌هاي اختصاصي ضد HIV-1 با استفاده از IgG ضد انساني مرتبط با آنزيم، مورد شناسايي قرار مي‌ گيرند.  يك واكنش كالريمتريك مثبت باند هايي را بر روي كاغذ نيترو سلولزي مطابق با موقعيت آنتي ‌ژن‌ هاي اختصاصي HIV-1 ظاهر مي ‌سازد. ملاك براي يك آزمون مثبت، هر دو باند مطابق با p24، gp41، و gp120/160 است. عدم وجود باند ها بيانگر نتيجه ی منفي مي ‌باشد، در حالي كه حضور باند هايي كه ملاك براي يك آزمون مثبت را بر آورده نمي‌ كنند، يك نتيجه نامشخص است. نتايج مثبت كاذب و منفي كاذب نسبتاً نادر هستند. بيماران مبتلا به HIV-2 ممكن است در وسترن بلات HIV-1 الگويی نامعمول بدهند؛ از اين رو، چنانچه HIV-2 مشكوك باشد، يك وسترن بلات HIV-2 ی جداگانه لازم است. براي بيماران با الايزاي مثبت و وسترن بلات نامشخص، آزمايش ‌هاي مكرر طي 2 هفته تا 6 ماه و ارزيابي باليني ضرورت دارد. نوزاد متولد شده از مادر آلوده به HIV-1 ممكن است وسترن بلات - مثبت داشته باشد، اما چنانچه نوزاد واقعاً به HIV-1 مبتلا نباشد، اين آزمون به تدريج منفي خواهد شد.

 

سنجش ‌ها براي شناسايي مستقيم عفونت HIV

الف) شناسايي آنتي ژن P24

براي شناسايي آنتي ژن P24 از الايزا استفاده مي ‌شود. آنتي ‌بادي‌ هاي آنتي P24 بر روي يك سطح جامد بي‌حركت شده و با سرم بيمار انكوبه مي‌شوند. مقدار P24 با استفاده از IgG ی آنتي HIV-1 مرتبط با آنزيم و يك واكنش كالريمتريك پي برده مي ‌شود. آنتي ژن P24 در جريان مرحله ويرمي حاد عفونت و در مرحله پاياني ايدز قابل شناسايي است. درصد بسيار اندكي از اشخاص بدون علامتِ مبتلا به عفونت HIV-1، آنتي‌ ژن P24 - مثبت هستند. آزمون آنتي ژن P24 در آمريكا به طور گسترده استفاده نمي‌ شود، اما در كشور هاي كم ‌درآمد براي تشخيص عفونت HIV، به ويژه در نوزادان، مورد استفاده است.

 

ب) شناسايي RNA ي HIV

انواعي از سنجـش‌ هاي تجـاري براي شناسايي و تعيين كمّي RNA ي HIV-1 در دسترس قرار دارند. اين سنجش‌ ها عبارتند از : PCR، NASBA، TMA، و سنجش‌هاي bDNA هم براي شناسايي و هم براي تعيين كمّي HIV-1 (بخش تشخيص ملكولي را در اوايل اين فصل ببينيد). سنجش ‌هاي كيفي را مي‌ توان براي شناسايي عفونت HIV-1 پيش از زمان عفونت، هنگامي كه آزمون‌ هـاي آنتي بادي مثبت مي ‌شونـد، براي حل سنجش‌ هـاي نامشخص وسترن بلات، و براي تشخـيص عفونت نوزادي به كار برد. سنجش ‌هاي كمّي براي پيگيري اثربخشي درمان ضد HIV-1 استفاده مي ‌شوند.

 

پ) شناسايي DNA ی پروويروسيِ HIV-1

DNA از سلول ‌هـاي تك هسته ‌اي به دست آمده از خون محيطيِ آنتي كوآگوله استخراج مي ‌شود. پرايمر هـاي اليگو نوكلئوتيدي اختصاصي برای قطعات DNA ی پروويروسي الحاق شده‌ ي HIV-1، در سنجش PCR مورد استفاده قرار مي‌ گيرند (بخش تشخيص ملكولي را در اوايل اين فصل ببينيد). اين نوع از سنجش را مي ‌توان براي يك نوزاد آنتي بادي مثبتِ متولد شده از مادر آلوده، به منظور تعيين اين كه آيا نوزاد نيز آلوده است، انجام داد. اين سنجش يك آزمون ارجح براي نوزادان زير 18 ماه مي‌ باشد.

 

ت) كشت HIV-1

كشت بافت نخستين آزمون توسعه يافته براي تشخيص عفونت HIV-1 است. اين روش براي تصديق HIV-1 به عنوان عامل ايدز مورد استفاده قرار گرفت. سلول ‌هـاي تك هسته ‌اي خون محيطي از يك بيمار بالقوه آلـوده با سلول ‌هـاي تك هسته ‌اي خون محيطي از يك فـرد سالم كـه با فيتو هماگلوتينين و اينترلوکين -2 تحـريك شده است، كشت داده مي ‌شونـد. كشت ‌ها براي تشكيل سلول‌ هاي غول آساي چند هسته ‌اي، براي فعاليت ترانسكريپتاز معكوس HIV-1، يا براي توليد آنتي ژن HIV-1 P24 مشاهده مي‌ گردند. كشت سلولي كمّي و كشت پلاسماي كمّي نيز مي ‌تواند انجام پذيرد. كشت HIV-1 99-95 درصد حساسيت دارد. كشت HIV-1 وقت گير و پرهزينه است و از اين رو براي استفاده روتين مقرون به صرفه نيست. تغييرات در تكنيك‌هاي كشت، در سنجش‌هاي فنوتيپي براي شناسايي مقاومت داروييِ ضد رترووويروسي مورد استفاده است. به رغم پيشرفت ‌هاي اخيـر، اين سنجش‌ هـا  پُركاربـر باقي مانـده و فقط در تعداد معـدودي از آزمايشگاه‌ هاي مرجع در دسترس هستند.

 

نظارت بر شمار سلول T ي CD4

شمار مطلق سلول T ي CD4 به طور گسترده براي نظارت بر وضعيت عفونت HIV-1 در بيماران استفاده مي ‌شود. اين شمارش به طور كلي با استفاده از سلول ‌هاي خون كامل رنگ ‌آميزي شده با آنتي ‌بادي‌ هاي آنتي CD4 نشان‌ دار شده با یک رنگ فلئورسنت به دست مي ‌آيد. گلبول ‌هاي قرمز ليز مي‌ شوند و سلول‌ هاي CD4 به كمك فلوسيتومتري مورد شمارش قرار مي ‌گيرند.

 

آزمون‌ هاي پيش آگهي و نظارت بر درمان

بار ويروسي بالا چنانچه با سطوح بالاي RNA ي HIV-1 سنجيده شده باشد، حاكي از يك پيش آگهي ضعيف است. به طور مشابه، شمار پايين سلول T ي CD4 بيانگر خطر براي يك عفونت فرصت طلب بوده و بنابراين يك پيش‌آگهي ضعيف‌تر را نشان مي دهد. هم بار ويروسي و هم شمار سلول Tي CD4 براي نظارت بر اثربخشي درمـان ضد رتروويروسي استفاده مي ‌شود. در حال حاضر آزمـون بار ويروسي به هنگام آغاز درمـان، به هنگام تغيير درمـان، و در فواصل معمول براي ارزيابي اثربخشي مستمر رژيم ‌هاي دارويي توصيه مي‌شود.

    سنجش ‌هاي ژنوتايپينگ (تعيين ژنوتيپ) از PCR ترانسكريپتاز معكوس براي تقويت RNA ي HIV-1 كه آنزيم ‌هاي هدف براي دارو هاي ضد رتروويروسي را به رمز در مي ‌آورد، سود مي‌ جويند. آناليز توالي ‌هاي تقويت شده اجازه تعيين جهش‌ هاي كد كننده ‌ي مقاومت به داروها را مي ‌دهد. اين آزمون ‌هاي مقاومت در مواقعي كه رژيم دارويي نخست يا رژيم دارويي چندگانه دچار شكست مي‌ شود يا در دوران بارداري توصيه مي ‌گردند.

 

پرسش ‌هاي مروري

1. يك زن 47 ساله به عنوان بخشي از درمان لوكمي ميیِلوئيدي مزمن، پيوند مغز استخوان داشته است. هنگامي كه وي در بيمارستان بستري بود، يك سوند وريدي مركزي براي تجويز مايعات به او اتصال داشت. در زمان پس از پيوند، بلكه پيش از پيوند، شمار گلبول سفيد بيمار بسيار پايين بود. او به تب دچار گرديد و كشت‌هاي خون انجام پذيرفت. كدام يك از حالات زير پيشنهاد مي‌ كند كه كشت‌ هاي مثبت خون ناشي از يك آلاينده است؟

الف) دو كشت خون وريدي محيطي مثبت با استافيلوكوكوس اروئوس

ب) دو كشت خون وريدي محيطي مثبت با استافيلوكوكوس اپيدرمايديس  همـراه با دو كشت خون خط مركزي مثبت با استافيلوكوكوس اپيدرمايديس [خط مركزي : يك سوند كه از طريق يك وريد به انتهاي بزرگْ سياهرگ (سياهرگ بزرگ بازگشت خون به قلب) يا دهليز راست قلب عبور داده مي‌شود].

پ) يك كشت خون وريدي محيطي مثبت و يك كشت خون خط مركزي مثبت با اشريشياكولي

ت) يك كشت خون خط وريدي مركزي مثبت با يك گونه كورينه باكتريوم و دو كشت خون وريدي محيطي منفي

ث) دو كشت خون خط مركزي مثبت با كانديدا آلبيكنس

 

2. يك مرد 22 ساله دو روز قبل، از يك‌ سفر 2 هفته‌ اي به مكزيك بازگشته است. در عرض 24 ساعت او به اسهال دچار مي ‌گردد. كدام يك از موارد زير اتیولوژي اسهال وي را تصديق نخواهد كرد؟

الف) كشت مدفوع براي سالمونلا، شيگلا، و كمپيلوباكتر

ب) كشت مدفوع براي روتارويروس و ويروس شبه نوروالك

پ) آنزيم ايمونواسي مدفوع براي آنتي ژن ژيارديا لامبليا

ت) بررسي مدفوع براي انتامبا هيستوليتيكا

 

3. يك مرد 37 ساله درجريان پاندمي ‌وبا به پرو سفر كرده است. او يك روز پس از بازگشت به خانه به اسهال آبكي شديد دچار مي‌شود. به منظور تسهيل در جدا سازي ويبريو كلرا از مدفوع وي، آزمايشگاه به كدام مورد نياز دارد؟

الف) مك كانگي آگار

ب) كمپيلوباكتر بلاد آگار

پ) تيوسولفات سيترات بايل سالتز سوكروز آگار

ت) بيسموت سولفات آگار

ث) هكتون آگار

 

4. يك مرد 42 ساله، مبتلا به ايدز شناخته شده است. كدام يك از موارد زير مناسب ‌ترين شيوه براي پيگيري پيشرفت درمان ضد رتروويروسي بسيار فعال (HAART) در او است؟

الف) تعيين بار ويروسي

ب) پيگيري سطوح آنتي بادي آنتي HIV-1

پ) استفاده از وسترن بلات براي ارزيابي سطوح آنتي P24

ت) كشت مكرر خون براي HIV-1، هنگامي كه كشت منفي مي‌ شود.

ث) ژنوتايپينگ جدا شده‌ ي HIV-1 براي تعيين حساسيت ضد رتروويروسي

 

5. يك كودك 2 ساله به اسهال دچار مي‌شود. عفونت روتاروويروس مشكوك است. كدام يك از موارد زير در تشخيص عفونت روتاروويروس بيش از همه مفيد مي ‌باشد؟

الف) رنگ ‌آميزي فلئورسنت آنتي بادي نمونه مدفوع

ب) بررسي با ميكـروسكوپ نوري براي يافتن سلول‌ هـاي مخاطي با اثـر سايتوپاتيك

پ) شناسايي آنتي ژن ويروس در مدفوع توسط سنجش جاذب ايمني مرتبط با آنزيم

ت) كشت ويروس

 

6. كداميك از موارد زير به منظور تشخيص اتیولوژيك (عامل مسبب) عفونت مناسب است؟

الف) كشت و شناسايي عامل

ب) هيبـريديزاسيـون DNA-DNA يا DNA-RNA جهت پي بـردن به ژن‌ هاي اختصاصي پاتوژن در نمونه ‌هاي بيمار

پ) اثبات آنتي بادي معني ‌دار يا پاسخ ايمني با واسطه سلول به يك عامل عفونت ‌زا

ت) شناسايي مورفولوژيك عامل در رنگ ‌آميزي نمونه‌ ها يا برش‌ هاي بافت، با استفاده از ميكروسكوپ نوري يا الكتروني

ث) شناسايي آنتي ژن عامل به واسطه سنجش ايمونولوژيك

ج) همه موارد

 

7. يك زن 45 ساله به دليل تب، كاهش وزن kg 6، و مورمور جديد قلبي در بيمارستان بستري مي ‌شود. تشخيص، اندوكارديت است. چه تعداد كشت و در چه مدت زمان بايد انجام شود تا مدركي از عفونت باكتريايي اختصاصي در اندوكارديت به دست آيد؟

الف) يك

ب) دو بيش از 10 دقيقه

پ) سه بيش از 2 ساعت

ت) سه بيش از 24 ساعت

ث) شش بيش از 3 روز

 

8. يك پسر 4 ساله به اسهال دچار مي‌ گردد. كوليت هموراژيك ناشي از اشريشياكولي O157:H7 مورد ظن است. براي تشخيص، كدام محيط بايد تلقيح شود؟

الف) بلاد آگار

ب) سوربيتول مك كانكي آگار

پ) هكتون انتريك آگار

ت) CIN (سفزولودين، ايرگاسان، نوووبيوسين) آگار

 

9. يك مرد 43 ساله غالباً با كاميون 18 چرخ خود از ميان دره مركزي كاليفرنيا مسافرت‌ هاي طولاني مي ‌كند. دو ماه قبل در حالي كه او در ميان اين دره رانندگي مي ‌كرد، يك گرد‌باد عظيم وجود داشت. وي دو هفته پس از آن به تب همراه با سرفه و درد سينه پلورتيك (پرده جنب) دچار گرديد. در راديوگرافي از قفسه سينه، ارتشاح ديده شد. تشخيص پنوموني بود،‌ و به بيمار اريترومايسين داده شد. طي سه هفته، ‌تب، سرفه،‌ درد پلورتيك، و ارتشاح برطرف می گردد. دو هفته قبل او به سردرد هاي به تدريج شديد شونده و از دو روز گذشته تا كنون به تهوع دچار شده است. مايع مغزي نخاعي وي حاوي 150 گلبول سفيد در هر ميكرو ليتر با غالبيت لنفوسيت‌ها بوده و غلظت گلوكـز پايين است. مننژيـت ناشي از كوكسيديوئيـدس ايميتيس مشكوك مي ‌باشد. كدام يك از آزمون ‌هاي زير حساس‌ ترين و مفيد ترين آزمون براي تأييد اين تشخيص مي ‌باشد؟

الف) سنجش آگلوتيناسيون لاتكس براي آنتي بادي ‌هاي كوكسيديوئيديايي، انجام شونده روي CSF

ب) آزمون تثبيت كمپلمان روي مايع مغزي نخاعي براي آنتي ‌بادي‌ هاي ضد كوكسيديوئيدس ايميتیس

پ) آزمون ايمونو ديفيوژن روي مايع مغزي نخاعي براي آنتي ‌بادي‌ هاي ضد كوكسيديوئيدس ايميتیس.

ت) كشت مايع مغزي نخاعي براي كوكسيديوئيدس ايميتيس

ث) آزمون تثبيت كمپلمان سرم براي آنتي ‌بادي ‌هاي ضد كوكسيديوئيدس ايميتیس

 

10. يك فرد 5 ساله ی دريافت كننده پيوند كليه كه با سيكلوسپورين تحت درمان قرار گرفته است، به يك اختلال لنفوپروليفراتيو دچار مي ‌گردد. كدام يك از ويروس ‌هاي زير متحمل‌ ترين مسئول اين اختلال است؟

الف) سايتومگالوويروس

ب) هرپس سيمپلكس ويروس

پ) ويروس كوكساكي B

ت) ويروس هپاتيت B

ث) اپستين بار ويروس

 

11. تمام موارد زير از دلايل مناسب جهت استفاده از آزمون ‌هاي سرولوژيك براي ويروس‌ ها هستند مگر :

الف) براي اشاره به حساسيت فرد به يك عفونت ويروسي خاص

ب) براي تشخيص هنگامي كه ويروس داراي يك دوره كمون طولاني است.

پ) براي اهداف غربالگري

ت) براي تأييد يك عفونت ويروسي

ث) براي نظارت بر پاسخ نسبت به درمان

 

12. يك پسر 2 ساله به تب حاد،‌ علائم سردرد، كاهش وضعيت ذهني، و سفتي گردن دچار مي‌گردد. طي معاينه، تب تأييد مي‌شود، سفتي خفيف گردن وجود دارد، و اگرچه كودك تحريك ‌پذير و در حالت خواب و بيداري است، برخي مايعات خوراكي به او داده مي ‌شود. پارامتر هاي مايع مغزي نخاعي، پروتئيـن (ميكروگـرم بر دسي ‌ليتر) μg/dL 60، گلوكـز μg/dL 40، و در مجـموع 200 گلبول سفيد، با غالبیت مونو نوكلئـر،‌ را نشان مي ‌دهنـد. محتمل‌ ترين عامل عفونت اين كودك كدام است؟

الف) باكتري

ب) ويروس

پ) تك ياخته

ت) قارچ

ث) مايكوباكتريوم

13. در مـورد فوق،‌ مفيد ترين آزمـون براي تشخيص قطعي سريـع عامل احتمالي مسبب كدام است؟

الف) آزمون آنتي ژن براي استرپتوكوكوس پنومونيه

ب) آزمون آگلوتينياسيون لاتكس براي آنتي ژن كريپتوكوكي

پ) آزمون تقويت اسيد نوكلئيك براي شناسايي RNA ی ويروسي

ت) كشت روي محيط‌ هاي انتخابي همراه با آزمون پروب براي تأييد

ث) اسمير مايع مغزي نخاعي،‌ رنگ آميزي شده با گيمسا

 

14. آزمون حساسيت با استفاده از روش MIC براي تمام عفونت‌ هاي زير ترجيح داده مي ‌شود، مگر :

الف) عفونت‌ هاي دستگاه ادراري

ب) اندوكارديت

پ) اوسئوميیليت

ت) باكتريمي در بيمار نوتروپنيك (كاهش در تعداد نوتروفيل ‌ها)

ث) مننژيت باكتريايي

 

15. واژينوز باكتريايي با تمام موارد زير به بهترين وجه تشخيص داده مي‌شود؛ مگر :

الف) اندازه‌گيري pH واژن

ب) پي بردن به بوي ماهي هنگامي كه ترشحات با KOH قليايي مي ‌شوند.

پ) كشت باكتريايي براي هوازي ‌ها و بي‌هوازي ‌ها

ت) بررسي اسمير رنگ آميزي شده گرم براي "سلول‌ هاي كليدي"

 

پاسخ ‌ها

1- ت

2- ب

3- پ

4- الف

5- پ

6- ج

7- ت

8- ب

9- ب

10- ث

11- ث

12- ب

13- پ

14- الف

15- پ

 
 

برای مطالعه سایر فصل های کتاب میکروب شناسی پزشکی جاوتز (جهاندیده و جهاندیده) بر روی فهرست کتاب کلیک نمائید.

 

 

 


اصول ميكروب ‌شناسي پزشكي , EIA , تشخيص اتيولوژيك (علت شناسی) عفونت , لاتكس آلگوتيناسيون , ‌آنزيم ايمونواسي , رنگ ‌آميزي آنتي باديِ نشان دار شده با فلئورسئين , ارتباط ميان پزشك و آزمايشگاه , تشخيص عفونت ‌هاي باكتريايي و قارچي , بررسي با ميكروسكوپ و رنگ ‌آميزي ‌ها , ميكروبيولوژي تشخيصي , NAAT , تكنيك ‌هاي تقويت اسيد نوكلئيك , nucleic acid amplification techniques , كالكوفلئور وايت , PAS , متنامين سيلور اسيد , شيف دوره‌اي , periodic acid, Schiff , رنگ ‌آميزي شده با نقره (سيلور) , سيستم ‌هاي كشت , مك كانكي آگار يا ائوزين , متيلن بلو [EMB] آگار , محيط‌ هاي بوردِت , ژانگو , محيط‌ حاوي چاركول (زغال چوب) , سوبسترا هاي كروموژنيك (رنگ زا) , آزمون ‌هـاي IF , زمون ‌هـاي فلئورسنت آنتي بادي مستقيم و غير مستقيم , EIA ها , سنجش‌هاي جاذب ايمني مرتبط با آنزيم (ELISA) , آزمون‌ هـاي آگلوتيناسيون واكنش كالريمتريك (رنگ سنجي) , آزمون آنتي ژن ادراري Binax NOW براي استرپتوكوكوس پنومونيه , پلي كلونال يا مونوكلونال , پروتئين A (سويه كوان I) , ايمونواسي های وسترن بلات , پروب DNA شركت Gen, Probe , هيبريديزاسيون در محل in situ, Woburn،MA , هيبريديزاسيون در محل اسيد نوكلئيك پپتيد , فلئورسنس يا PNA , پروتكل ‌هاي PCR رئال تايم , , AdvanDx , شناسايي باكتري ‌ها با استفاده از rRNA ی S16 , تِروفريما ويپِلِئي , عامل بيماري ويپِل , , FISH , سيستم ‌هاي تقويت هدف , peptide nucleic acid–fluorescence in situ hybridization , واكنش زنجيره‌ اي پليمراز (PCR) , دناچوره شدن , denaturation , آنيلينگ يا هيبريد شدن , annealing , بسط پرايمر , primer extention , PCR ترانسكريپتاز معكوس , reverse transcriptase PCR , آنزيم ترانسكريپتاز (نسخه بردار) معكوس , LCR , رونويسي RNA به DNA , عفونت بوردتلا پرتوسيس (سياه سرفه) , سيستم ‌هاي تقويت پروب , واكنش زنجيره ‌اي ليگاز , ligase chain reaction , شكاف (gap) , تكنيك‌ هاي تقويت سيگنال , TMA , آنزيم‌ هاي فلئورسنس , branched DNA , سيستم DNA منشعب , bDNA , سيستم ‌هـاي تقويت با واسطه رونويسي , transcription, mediated amplification , تقويت مبتني بر تولید اسيـد نوكلئيك‌ , NASBA , nucleic acid sequence, based amplification , سنجش ‌هاي ايزوتِرمال (هم دما) , آنزيم ‌هاي ترانسكريپتاز معكوس، RNase H , سنجش‌ هاي جا به‌ جايي رشته , SDA , strand displacement assays , سنجش‌ هاي تقويت ايزوترمال‌ , اندوكلئاز تحديدي , تقويت ايزوترمال با واسطه حلقه , LAMP , تقويت رئال تايم , PCR رئال تايم ترموسايكلِر هاي (چرخش دهنده‌ هاي حرارتي) , ملكول ‌هاي فلئوروژنيك , fluorogenic , سبز SYBR , روش‌ هـاي شناسايي اختصاصي آمپليكون , MS , محصول PCR , TaqMan پروب ‌هاي هيدروليز , FRET , پروب ‌هاي انتقال انرژي فلئورسنس , fluorescence energy transfer , نشان‌ هاي ملكولي molecular beacons , طيف سنجي جرمی , mass spectrometry , طيف سنجي جرمي يونيزاسيون / دفع ليزري به كمك ماتريكس با زمان پرواز MALDI, TOF MS , matrix –assisted desorption ionization time, of flight mass spectroscopy , PCR برچسب جرمي (MassTag PCR) , برچسب (tag) , طيف سنجي جرمي يونيزاسيون الكترواِسپري PCR , PCR, ESI, MS (PCR electrospray ionization mass spectroscopy) از يك نرم افزار آیبيس پِلَت فُرم (Ibis platform) , MALDI بيوتايپر (MALDI Biotyper) , شيمادزو (Shimadzu) , سرعت‌ هاي متفاوت "پرواز , زمان پرواز [time of flight]) , اهميت ميكروبيوتاي نرمال باكتريایی و قارچي , آزمون حساسيت انتشار ديسك , disc diffusion susceptibility test , پني‌ سيلين ‌هاي آنتي پسودومونايي , مؤسسه استانداردهاي باليني و آزمايشگاهي , CLSI , clinical and laboratory standards Institute , آزمون نيمه كمّي حداقل غلظت‌ مهاري , minimum inhibitory concentration , MIC , حـداقل غلظت باكتري سيدالي يا MBC , minimum bactericidal concentration , تشخيص عفونت بر اساس جايگاه آناتوميك , تكنيك ‌هاي آسپتيك آسپيره (مكش) , نمونه آنتي گوآگوله (ضد لخته) , مطالعه سيتولوژيك (سلول‌ شناسي) , ماهيت نئوپلاستيك (بدخيمي) , پروتئينوري , حضور پروتئين در ادرار , , باكتری يوري , حضور باكتري در ادرار, پيوري , حضور چرك در ادرار , كشت ادرار , سندرم پيشابراه , انسداد پيشابراه , سل مثانه , مايع مغزي نخاعي , ترشحات تنفسي , اندوسِرويسيـت , سوزش غشـاي مخاطي در گردن رحم , سوزاك , عفونت ‌هاي تناسلي كلاميديايي , هرپس (تبخال) تناسلي , سفليس , آزمون فلوكولاسيون مثبت , سنجش‌ هاي شميلومينسنس , شانكروئيد گرانولوم كشاله ران , واژينوز / واژينيت , عفونت ‌هاي بي ‌هوازي , عفونت‌هاي پيرامون دندان , آبسه‌هاي پيرامون دهان , سينوزيت و ماستوئيديت , التهاب زائده پستاني , سيستم عصبي مركزي , عفونت ‌هاي درون شكمي و لگن , عفونت ‌هاي پوست و بافت نرم , تشخيص عفونت ‌هاي كلاميديايي , كولدوسنتزيس يـا مكش از لوله رحم , culdocentesis , CF , آزمون تثبيت كمپلمان , complement fixation , كليه ميمون سبز آفريقايي , African green monkey kidney , كليه هامستر نوزاد , baby hamster kidney , تثبيت كمپلمان , , اثر آسيب سلولي , cerebrospinal fluid , cytopathic effect , سنجش ايمني آنزيم , enzyme immunoassay , فلئورسنت آنتي بادي , fluorescent antibody , مهار هِم اَدزورپشن , hemadsorption inhibition كليه جنيني انسان , , human embryonic kidney , ريه جنيني انسان , human embryonic , HEP, 2 , , سلول ‌هاي اپيتليال انساني نوع 2 human epithelial type 2 cells , فيبروبلاست ‌هاي پوست ختنه‌گاه انسان , human foreskin fibroblasts , مهار هماگلوتيناسيون , hemagglutination inhibition , بررسي با ميكروسكوپ الكتروني ايميـون , , immune electron microscopy LLC, MK2 , رده سلول كليه ميمون , monkey kidney cell line رده سلول كليه سگ , dog kidney cell line , آزمون تقويت اسید نوكلئيك , nucleic acid amplification , سلول ‌هاي خون محيطي , preipheral blood cells كليه اوليـه ميمون , primary monkey kindly وِرو , Vero , رده سلول كليه ميـمون , monkey kidney cell line , آماده سازي تلقيح , Enzyme, Linked Virus, Inducible System , كشت ‌هاي شِل ويال (كشت پيشرفته با سانتريفيوژ) , طريق شركت تجـاري Quidel/Diagnostic Hybrids , سيستم القا پذیر با ويروس , ميكروسكوپ الكتروني ايميون , immune electran microscope , آزمون‌ هاي پيش آگهي و نظارت بر درمان

نام و نام خانوادگی:
متن:
تصویر:

نظرات و پیشنهادات

عضویت در سایت

پشتیبانی آنلاین

نام و نام خانوادگی:
پست الکترونیک:
متن:

نام کاربری:
کلمه عبور:
کلمه عبور را بخاطر بسپار
کلمه عبور خود را فراموش کرده ام
عضویت در سایت

نام و نام خانوادگی:
پست الکترونیک:
شماره موبایل:
گفتگو با:


کتاب دانلود : دانلود کتاب های علمی و دانشگاهی روز دنیا. هرگونه کپی برداری از محتوا، قالب، و طرح های به کار رفته در این سایت شرعا و قانونا ممنوع می باشد، و پیگرد قانونی دارد.